氮素的同化是植物生长和发育的一个十分重要的生理过程。其中,无机氮必须同化为谷氨酰胺合成酶(GS)是参与这一氨同化过程的关键酶。此外,GS也是分子生物学中研究基因专一性表达和时空表达及基因表达调控的好模式,因为其表达既有组织器官专一性,又受环境(光、氮、二氧化碳等)和发育因子的影响。正因如此,植物谷氨酰胺合成酶才成为人们感兴趣的研究热点之一。
谷氨酰胺和羟胺在谷氨酰胺合成酶的作用下生成Υ–谷氨酰氧肟酸和氨,通过显色反应可测定谷氨酰氧肟酸的含量。
测定原理
GS 在 ATP 和 Mg2+的存在下,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺进一步转化为γ-谷氨酰基异羟肟酸,在酸性条件下形成的络合物在 540nm 处有最大吸收峰,可用分光光度计测定其吸光值来判定 GS 的活力。
产品优点如下:
1、快速简便:全程约30分钟,可测50例左右样本。
2、取样量微:本法取样本量50l。
3、稳定性好:试剂盒2~8℃存放6个月有效。
4、再现性好:变异系数CV=1.7%。
5、回收试验: X =103%。
6、受外界影响因素小:干扰因素少,重复性强。
7、测试面广:可测动物血清(浆)、组织。
试剂组成和配置(50T/24 样)
提取液:30ml×1 瓶,4°C保存。
试剂一:12ml×1 瓶,-20°C保存。使用时 37°C预热 20min,充分混匀,如有沉淀,静置 10min,
取上清待用。
试剂二:12ml×1 瓶,-20°C保存。使用时 37°C预热 20min,充分混匀,如有沉淀,静置 10min,取上清待用。
试剂三:粉剂×2 瓶,-20°C保存。使用时每瓶粉剂加入 5ml 蒸馏水充分溶解待用。
试剂四:15ml×1 瓶,4°C保存。
所需仪器及自备试剂:
1、分光光度计/酶标仪/半自动生化分析仪(比色测定波长为550nm)
2、恒温水浴箱或气浴箱 (孵育温度为37℃)
3、台式离心机
4、漩涡混匀器
5、微量移液器
样本收集与前处理:
血清(浆)可直接测定。
动物组织样本:可用生理盐水按重量体积比制备成组织匀浆液,离心取上清测定。
具体的样本前处理:参考我们随货发送的《实验方法学》以及试剂盒中详细说明书。
操作流程:
1、按说明书操作加入混合试剂和样本
2、漩涡混匀,37℃孵育15分钟
3、加入显色剂显色,3500转/分,离心5~10分钟
4、550nm波长,0.5cm光径,比色