氢氧自由基(OH-)是化学性质最活泼的活性氧,它几乎与细胞内的每一类有机物如糖、氨基酸、磷脂、核苷酸和有机酸等都能反应,并且有非常高的速度常数,因此它的破坏性极强,但它可以被过氧化氢酶分解,因而测定过氧化氢酶的高低就有其重要意义。
检测原理:
红细胞或组织中过氧化氢酶(CAT)在一定条件下能直接分解其底物过氧化氢(H2O2),使H2O2在反应液中的浓度逐渐降低,相应的吸光度也逐渐下降。
试剂组成与配制(100 管/96 样):
试剂一:30ml 水剂贮备液×1 瓶,4°C保存 6 个月。
试剂二:甲粉×1 瓶,乙粉×1 瓶,4°C保存 6 个月。用时各加双蒸水 200ml,完全溶解后混
合一起,用双蒸水定容至 500ml,配成应用液,4°C保存 3 个月。
操作步骤:
1﹑样本前处理:
①﹑溶血液的制备:
取老鼠的新鲜血液 50l 加双蒸水至 2.5ml 混匀配成 1:49 溶血液。
②﹑1%肝组织匀浆的制备:
按《实验方法学》制备 10%肝组织匀浆,再取部分 10%肝组织匀浆,用生理盐水按1︰9 稀释制备成 1%肝组织匀浆。
注:如果样本(脑组织、神经组织等)的 CAT 活力太低,可以加大样本浓度或增加取样量。
2﹑测定过程:
取 1cm 光径石英比色皿,紫外 240nm,双蒸水调零备用。取经过前处理的样本 0.02ml加入比色皿底部,将已预温至 25°C,OD 在 0.5~0.55 之间的底物溶液 3ml 直接用 5ml或 10ml 的大移液器快速冲入比色皿中,240nm 处立即测定吸光度,记下 OD1 值,比色皿不要取出,1 分钟时立即再测一次吸光度,记下 OD2 值。(没有大移液器可用滴管或细玻棒快速混匀 1~2 次)