淀粉酶(EC₃.2.1.1)是催化淀粉水解的一类酶的总称。土壤中的淀粉酶主要来自于微生物，是一种重要的酶制剂，广泛应用于粮食加工、食品、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业。

淀粉酶水解淀粉产生还原糖，可与3,5-二硝基水杨酸反应生成红棕色物质，在540nm处有特征吸收峰，颜色深浅在一定范围内与还原糖量成正比。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1.试剂二：临用前加入5ml蒸馏水，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌或震荡至粉剂溶解。

2.标准品：10mg麦芽糖。临用前加入1.38ml蒸馏水配制成20μmol/ml的储备液。

需自备的仪器和用品：

天平、水浴锅、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、30～50目筛、研钵、甲苯(不允许快递)。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可参考文献)

新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干，过30～50目筛。

二、测定步骤

1.分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至540nm，蒸馏水调零。

2.将20μmol/ml的麦芽糖储备液用蒸馏水稀释为2、1、0.8、0.6、0.4μmol/ml的标准溶液备用。

3.步骤：

三、土壤淀粉酶活力的计算

1.标准曲线的绘制：

以标准溶液的浓度为 x轴，ΔA标准为 y轴绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b。将ΔA测定带入方程得到x(μmol/ml)。

2.酶活的计算：

单位的定义：每天每 g土样产生 1μmol还原糖定义为一个土壤淀粉酶活力。

S-AL(U/g土样)=x×V反总÷W÷T=0.21×x÷W

V反总：酶促反应总体积，0.21ml；W：土样质量，g；T：反应时间，1d。

注意事项：

1.当ΔA大于 1.5时，建议将上清液稀释后再进行测定，注意在计算公式中乘以稀释倍数。

2.若ΔA测定较小，增加反应的上清液体积或适当增加酶促反应时间，计算酶活时对公式进行修改。

3.建议每次实验煮沸后的冷却时间保持一致，吸光值请于 30min内测定完成。

实验实例：

1.取 0.05g土样于 1.5mlEP管中，依次加入 10μL甲苯、100μL试剂一、100μL试剂二为测定管；取 0.05g土样于 1.5mlEP管中，依次加入 10μL甲苯、100μL试剂一、100μL蒸馏水为对照管，均放于 37℃培养 24h，后离心取上清再液稀释 3倍 ，之后按照测定步骤操作 ，用 96孔板测得计算 ΔA=A测定管 -A对照管=0.948-0.12=0.828，标准曲线：y=0.7604x-0.158，x=1.297，按土样质量计算酶活得：S-AL(U/g土样)=0.21×x÷W×3(稀释倍数)=0.21×1.297÷0.05×3(稀释倍数)=16.34U/g土样。

参考文献：

[1] Kathiresan  K,  Manivannan  S.  α-Amylase  production  by Penicillium fellutanum  isolated  from  mangrove rhizospHere soil[J]. African journal of Biotechnology, 2006, 5(10).

[2] Ebregt A, Boldewijn J. Influence of heavy metals in spruce forest soil on amylase activity, CO 2 evolution  from starch and soil respiration[J]. Plant and Soil, 1977, 47(1): 137-148.