菠萝蛋白酶(Bromelain)简称菠萝酶，亦称凤梨酶、凤梨酵素等，是存在于菠萝植株中的蛋白水解酶，可从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到，菠萝蛋白酶已被广泛应用于食品、医药等行业。利用吸附力、离子键、共价键等不同的联结方式，将酶与不溶性载体联结，制成固定化酶，可以很好的避免酶的失活，易于储存运输。

菠萝蛋白酶检测试剂盒(福林酚微板法)检测原理是通过蛋白酶催化底物酪蛋白，后者水解生成酪氨酸，酪氨酸含有酚羟基，可与福林酚试剂发生福林酚反应，即福林酚试剂在碱性条件下容易定量的被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，呈现不同深浅的蓝色。于酶标仪检测吸光度，以吸光度的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸光度大说明酪氨酸含量高，也就是说菠萝蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活性高。该试剂盒主要用于植物组织尤其时菠萝的匀浆液中菠萝蛋白酶活性，尤其适用于检测菠萝中菠萝蛋白酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

产品组成：

自备材料：

1.蒸馏水

2.研钵或匀浆器

3.离心管

4.离心机

5.酶标板

6.酶标仪

操作步骤(仅供参考)：

1.准备样品：

①植物样品：取10g菠萝肉或植物组织，切碎后在研钵或匀浆器中加入等体积组织匀浆液进行研磨或匀浆，4℃静置30min，滤纸或4～6层纱布过滤，留取滤液，边搅拌边加入10ml Bromelain Lysis buffer，搅拌约10min，4℃静置1h，4℃4000r/min离心7～10min，弃上清液，收集沉淀，加入2～3倍体积的Bromelain洗脱液，搅拌洗脱20min。再次4℃4000r/min离心7～10min，取上清液，-20℃冻存，用于菠萝蛋白酶的检测。

②固定化酶：称取适量的固定化酶，溶解于0.5ml组织匀浆液，混匀，-20℃冻存待用。

③高活性样品：如果样品中含有较高活性的菠萝蛋白酶，可以使用蒸馏水或组织匀浆液进行恰当的稀释。

2.处理待测样品：取两支离心管，按下表顺序依次操作。含有测定液和对照液的离心管室温放置15min，3000r/min离心7～10min，分别取上清液待用。

单位：ml样品对照孔

待测样品(提前40℃孵育)            0.1

酪蛋白终止液(提前40℃孵育)        0.3

摇匀灭活。

酪蛋白溶液(提前40℃孵育)          0.1

混匀后40℃准确孵育10min。

单位：ml样品测定孔

待测样品(提前40℃孵育)            0.1

酪蛋白溶液(提前40℃孵育)          0.1

混匀后40℃准确孵育10min。

酪蛋白终止液(提前40℃孵育)        0.3

摇匀灭活。

3.稀释系列酪氨酸标准：取适量的酪氨酸标准(0.1mg/ml)，按下表配制不同浓度的酪氨酸标准备用。

4.Bromelain加样：取96孔板，按照下表设置空白孔、标准孔、样品对照孔、样品测定孔，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的菠萝蛋白酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测**能设置2平行管，求平均值。

5.Bromelain测定：充分混匀，40℃孵育显色15min，以对照孔调零，酶标仪测定680nm处测定孔的吸光度；同时以空白孔调零，酶标仪测定680nm处系列酪氨酸标准(1～5号)孔的吸光度。

计算：

以系列酪氨酸标准(1～5号)浓度(mg/ml)为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，绘制酪氨酸标准曲线，通过样品测定管的吸光度，在标准曲线上查得各测定孔中酪氨酸浓度。菠萝蛋白酶活性单位的定义：在40℃pH7.0时，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为一个活性单位。其比活力定义：每毫克蛋白所含蛋白酶活力单位的数量。

菠萝蛋白酶(U)=(测定液的酪氨酸浓度×1000)/15

式中：测定管的酪氨酸浓度单位为mg/ml；1000=μg与mg的单位换算；15=孵育时间15min

注意事项：

1.待测样品中不能含有酶抑制剂，同时需避免反复冻融。

2.菠萝蛋白酶提取时，注意低温操作，防止酶活性，亦可-20℃保存。

3.如果没有酶标仪，也可以使用分光光度计测定。每次检测指标不宜过多，否则操作时间不一，有可能导致样本间的差异。

4.离心时**采用低温离心机，常温离心机也可。

5.酪蛋白终止液有一定腐蚀性，请小心操作。

6.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：6个月有效。4℃运输，4℃保存。