MDHAR催化MDHA还原生成AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

MDHAR催化NADH还原MDHA生成AsA和NAD+，NADH在340nm有特征吸收峰，但是NAD+没有。通过测定340nm光吸收下降速率，来计算出MDHAR活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.试剂二：临用前加入5ml蒸馏水充分溶解，4℃保存；

2.试剂三：临用前加入5ml蒸馏水充分溶解，可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融；

3.试剂四：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加5ml试剂一充分溶解，可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。

需自备的仪器和用品：

研钵/匀浆器、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1ml石英比色皿、可调式移液枪和双蒸水。

操作步骤：

一、样本处理理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

1.组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)1：5-10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液)进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2.细菌、细胞：按照细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为500-1000：1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液)，冰浴超声破碎细胞(功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min)；然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1.分光光度计预热30min，调节波长到340nm，蒸馏水调零。

2.试剂一在25℃水浴锅中预热30min。

3.依次在石英比色皿中加入下列试剂

迅速混匀后于340nm比色，记录30s和150s的吸光值。分别记为A1、A2，ΔA=A1-A2，得到ΔA测定管、ΔA空白管。

三、MDHAR活性计算：

1.按蛋白浓度计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。

MDHAR (U/mg prot) =[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶]÷(Cpr×V样)÷T=0.268×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷Cpr

2.按样本质量计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。

MDHAR (U/g质量) =[(ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶]÷(V样÷V样总×W)÷T=0.268×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷W

3.按细胞数量计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为一个酶活单位。

MDHAR (U/10⁴cell) =[ (ΔA测定管-ΔA空白管)÷(ε×d)×V反总×10⁶]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=0.268×(ΔA测定管-ΔA空白管)÷细胞数量

ε：NADH摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；106：单位换算系数，1mol=1×10⁶μmol；V反总：反应体系总体积，1ml=0.001L；V样：加入反应体系中上清液体积，300μL=0.3ml；V样总：提取液体积，1ml；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/ml，蛋白质浓度需要另外测定；W：样本质量，g；细胞数量：以104为单位计量，万个；T：反应时间，2min。

注意事项：

1.当ΔA测定大于0.3时，建议客户稀释样本或者调整试剂一和上清液的比例(如将400μL试剂一+300μL上清液改为600μL试剂一+100μL上清液)后进行测定。

2.当ΔA测定过小时，建议客户提高样本量或者调整试剂一和上清液的比例(如将400μL试剂一+300μL上清液改为 200μL试剂一+500μL上清液)。

3.当A1大于1.5时，建议将样本稀释进行测定。

4.空白管为检测各管试剂组份的检测孔，正常情况下，其OD值在0.5左右，变化不超过0.01。

5.由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1mg/ml)，所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。