注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

MDHAR催化MDHA还原生成AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。 MDHAR催化NADH还原MDHA生成AsA和NAD+，NADH在340 nm有特征吸收峰，但是NAD+没有。通过测定340 nm光吸收下降速率，来计算出MDHAR活性。

产品内容：

提取液：液体110ml×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体15ml×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入2 ml蒸馏水充分溶解。

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加入2.5 ml蒸馏水充分溶解。

试剂四：液体×1瓶，-20℃避光保存。临用前加2ml试剂一充分溶解。

需自备的仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪和双蒸水

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)1：5-10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为500-1000：1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液)，冰浴超声超声破碎细胞(功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min)；然后10000rpm，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

二、MDHAR测定操作：

1.分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2.试剂一在25℃水浴锅中预热30 min。

3.依次在微量石英比色皿/96孔UV板中加入下列试剂

迅速混匀后于340nm比色，记录30s和150s的吸光值,分别记为A1、A2，ΔA=A1-A2，得到△A测定，△A空白。

三、MDHAR 活性计算：

(1)按蛋白浓度计算 MDHAR活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1U。

MDHAR (U/mg prot) = [(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×10⁶]÷(Cpr×V样)÷T=0.804×(△A测定-△A空白)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每克样品每分钟氧化1μmol NADH为1U。

MDHAR (U/g鲜重) =[(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×10⁶]÷(V样÷V样总×W)÷T=0.804×(△A测定管-△A空白管)÷W

(3)按细胞数量计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1U。

MDHAR (U/10⁴ cell) =[ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=0.804×(△A测定管-△A空白管)÷细胞数量

ε：NADH摩尔消光系数，6220L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；106：1mol=1×10⁶μmol；V反总：反应体系总体积，0.2ml=2×10^-4L；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02ml；V样总：提取液体积，1 ml；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/ml，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒；W  ：样品质量， g；T：反应时间，2min；细胞数量：万个。

(1)按蛋白浓度计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADH为1U。

MDHAR (U/mg prot) = [(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×10⁶]÷(Cpr×V样)÷T=1.340×(△A测定-△A空白)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每克样品每分钟氧化1μmol NADH为1U。

MDHAR (U/g鲜重)=[(△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×10⁶]÷(V样÷V样总×W)÷T=1.340×(△A测定-△A空白)÷W

(3)按细胞数量计算

MDHAR活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟氧化1μmol NADH为1U。

MDHAR (U/10⁴ cell) =[ (△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=1.340×(△A测定管-△A空白管)÷细胞数量

ε：NADH摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；106：1mol=1×10⁶μmol；V反总：反应体系总体积，0.2ml=2×10^-4L；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02ml；V样总：提取液体积，1 ml；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/ml，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA试剂盒；W  ：样品质量， g；T：反应时间，2min；细胞数量：万个。