PDH(EC 4.1.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。

PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP)，从而导致605nm光吸收的减少。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

试剂二：为易挥发试剂，用完后尽快密封，-20℃保存。工作液的配制：临用前把5.75ml试剂四、一支试剂五、0.45ml试剂六、1.75ml试剂七转移到一瓶试剂三中混合溶解待用(共15.45ml，约85T)；用不完的试剂-20℃分装保存，可保存4周。避免反复冻融。

所需的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

组织：称取约0.1g组织，加入1ml试剂一和10μL试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨，4℃ 11000g离心10min，取上清，置冰上待测。细胞或者细菌样本：先收集500万细胞或细菌到离心管内，离心后弃上清；之后加入1ml试剂一和10μL试剂

二，冰浴超声波破碎细菌(功率200W，超声3s，间隔7s，总时间5min)；然后11000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

血清(浆)及其它液体样本：直接检测。若溶液有浑浊则离心后去上清进行测定。

二、测定步骤

1.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至605nm，分光光度计蒸馏水调零。

2.每个样本需要180μL工作液，按样本数取出一定量的工作液于37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)中水浴10min。

3.空白管：在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL水，混匀，立即记录605nm处10s处吸光值A1和1min10s后的吸光值A2，计算ΔA空白=A1-A2。空白管只需测1-2次。

4.测定管：在微量比色皿或96孔板中加入180μL工作液和10μL样本，混匀，立即记录605nm处10s处吸光值A3和1min10s后的吸光值A4，计算ΔA测定=A3-A4。

三、PDH活性计算

1.按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/mg prot)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=904.762×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

2.按样本质量计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/g质量)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=913.81×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

3.按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/10⁴cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.828×(ΔA测定-ΔA空白)

4.按样本体积计算

单位的定义：每ml液体在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/ml)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷V样÷T =904.762×(ΔA测定-ΔA空白)

V反总：反应体系总体积，1.9×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴L/mol/cm；d：比色皿光径，

1cm；V样：加入样本体积，0.01ml；V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01ml；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

1.按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/mg prot)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V样)÷T=1809.524×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

2.按样本质量计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/g质量)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样÷V样总×W)÷T=1827.62×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

3.按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/10⁴cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样÷V样总×500)÷T=3.655×(ΔA测定-ΔA空白)

4.按样本体积计算

单位的定义：每ml液体在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/ml)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹ ]÷V样÷T=1809.524×(ΔA测定-ΔA空白)

V反总：反应体系总体积，1.9×10 -4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴L/mol/ cm；d：96孔板光径，

0.5cm；V样：加入样本体积，0.01ml；V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01ml；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1.测定过程中所有样本在冰上放置并于2小时内检测，以免变性和失活。

2.测定管的ΔA值在0.01-0.25之间，若测定管的ΔA值大于0.25，需将样本进行稀释。计算公式中乘以稀释倍数。若测定管的ΔA值小于0.01，需加大样本量后重新测定，注意同步修改计算公式。

3.由于试剂一中含有一定浓度的蛋白(约1mg/ml)，所以在测定样品蛋白浓度时需要减去试剂一的蛋白含量。