注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其 是药物和毒物的代谢。NCR 作为 P450 酶系的重要一员，催化氧化型 P450 还原再生。

测定原理：

NCR 催化 NADPH 还原氧化型细胞色素 C，还原型细胞色素 C 在 550nm 处有特征吸收峰； 通过测定 550nm 吸光度的增加速率，来计算 NCR 活性。

自备仪器和用品：

普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一:粉剂×2 瓶，4℃保存。临用前根据用量每瓶加 100mL 蒸馏水充分溶解。

试剂二:液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三:粉剂×1 管，-20℃保存。临用前配制，加 1.04 mL 蒸馏水充分溶解，4℃保存。

试剂四:粉剂×1 管，4℃保存。临用前配制，加 1100 μL 蒸馏水充分溶解，4℃保存。

粗酶液提取：

1、除去细胞核和线粒体等:称约 0.5g 组织，加入 4℃预冷的 1 mL 试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心 30min，取上清液，转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体:4℃，100 000g，离心 60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质:向步骤 2 的沉淀中加 1 mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min，弃上清液。

4、最终微粒体:向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，4℃保存待测。

NADPH-细胞色素 C 还原酶测定操作：

1.  分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 550 nm，蒸馏水调零。

2.  试剂二在 37℃水浴中预热 30min。

3.  空白管:取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 10μL 蒸馏水、180μL 试剂二、10μL 试剂 三和 10μL 试剂四，迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化，第 10s 和第 130s 吸光 值。△A 空白管=A2-A1。

4.  测定管:取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 10μL 提取液、180μL 试剂二、10μL 试剂 三和 10μL 试剂四，迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化，第 10s 和第 130s 吸光 值。△A 测定管=A4-A3。

注意:空白管只需做一次。

NCR 活性计算公式公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 (1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生 1μmol 还原型细胞色素 C 为 1 个酶活单位。

NCR ((nmol/min /mg prot)= (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T= 550×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:37℃中，每克组织每分钟催化产生 1μmol 还原型细胞色素 C 为 1 个酶活单 位。

NCR ((nmol/min/g  鲜重)= (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T=275×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

ε:还原型细胞色素 C 摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d:比色皿光径(cm)，1cm；V 反总:反应体系总体积(L)，210μL=2.1×10^-4L；Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL)， 需要另外测定；V 样:加入反应体系中上清液体积(mL)，10μL=0.01mL；V 样总:提取液 体积，0.5 mL；T:反应时间(min)，2min。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:37℃中，每毫克蛋白每分钟催化产生 1μmol 还原型细胞色素 C 为 1 个酶活 单位。

NCR ((nmol/min/mg prot)= (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T= 1100×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:37℃中，每克组织每分钟催化产生 1μmol 还原型细胞色素 c 为 1 个酶活单位。

NCR ((nmol/min/g  鲜重) = (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T= 550×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

ε:还原型细胞色素 C 摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d:96 孔板光径(cm)，

0.5cm；V 反总:反应体系总体积(L)，210μL=2.1×10^-4L；Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL)， 需要另外测定；V 样:加入反应体系中上清液体积(mL)，10μL=0.01mL；V 样总:提取液 体积，0.5mL；T:反应时间(min)，2min。

注意事项:

试剂三、试剂四临用前配制，配好未使用完的 4℃可保存两天。