正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ME 广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和 CO2，以及伴随 NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME 活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物 ME 活性测定较多， 已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将 ME 分为 NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.1.40)。

测定原理：

NADP-ME 催化 NADP+还原成 NADPH，在 340nm 下测定 NADPH 增加速率。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存。；

试剂一：液体 30mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 20mL 试剂一充分振荡，溶解待用，用不完的试剂分装后-20 度保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 2.5mL 蒸馏水充分振荡，溶解待用，用不完的试剂分装后-20 度保存，禁止反复冻融。

样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴ 个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或200W，超声  3s，间隔  10s，重复  30 次)；14000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液)，进行冰浴匀浆。14000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清(浆)样品：直接检测。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 170μL 试剂二，混匀，30℃孵育 5min， 加入 20μL 试剂三，混匀后立即记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

NADP-ME 活性计算：

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-ME(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T= 3215×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-ME(nmol/min/g  鲜重)＝[ΔA×V  反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×  V  样÷V  样总)÷T =3215×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。NADP-ME(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T =6.43×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-ME(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(Cpr×V 样) ÷T= 6431×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-ME (nmol/min/g  鲜重)＝[ΔA×V  反总÷( ε×d)×10⁹]÷(V  样÷V  样总×W)÷T=6431×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 NADP-ME(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样÷V 样总×500) ÷T =12.86×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4  L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³  L / mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。