正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预

测定测定意义：

NADPase 主要存在于植物组织中，是生物体内**催化 NADP+降解为 NAD+的酶，与 NADK一起调控 NAD 和 NADP 之间的平衡。

测定原理：

NADPase  能够催化 NADP+水解为 NAD+和无机磷的反应，通过测定无机磷的量来测定NADPase 活性。

所需的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 15 mL×1 瓶， 4℃保存。

试剂二：粉剂×4 支，-20℃保存；用时加入 1 mL 试剂一充分溶解备用，现配现用。

试剂三：粉剂×1  瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃可保存一周。

试剂四：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃可保存一周。

试剂五：液体 25mL×1  瓶，室温保存。

试剂六：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1  瓶，4℃保存。

0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂六 20 倍稀释，即取 0.5mL 试剂六加 9.5 蒸馏水， 充分混匀。

定磷试剂的配制：按 H2O: 试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1  的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。

注意：配试剂**用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

样本的前处理：

按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

操作步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。

2、酶促反应(在 EP 管中加入下列试剂)

37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 5min

37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)准确反应 30min 后，95℃水浴 5min(盖紧，以防止水分散失)，冷却后，10000g 25℃离心 5min，取上清

3、定磷(在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂)

混匀，25℃室温放置 30min，在  660nm 处，记录各管吸光值。

注意事项：

1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液，一定要洗得非常干净，要先用洗洁精加水煮，再用自来水冲，最后用蒸馏水冲干净。**用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。

2、标准管、空白管和对照管只要做一次即可。

NADPase 酶活性计算：

1、按组织蛋白浓度计算：

定义：每小时每毫克组织蛋白 NADPase 分解 NADP 产生 1μmol 无机磷的量为一个 NADPase

活力单位。

NADPase (μmol/h/mg prot)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷ (V 样×Cpr)÷T=5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr

2、按样本鲜重计算：

定义：每小时每 g 组织 NADPase 分解 NADP 产生 1μmol 无机磷的量为一个 NADPase 活力单位。

NADPase (μmol/h /g 鲜重)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V总÷(W× V 样÷V 样总)÷T=5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.2mL；V 样：加入样本体积，0.04mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5 小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。