焦磷酸：果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP，EC₂.7.1.90)是一种胞质酶，广泛存在于植物组织中，与磷酸果糖激酶一样催化果糖-6-磷酸的磷酸化，单PEP催化反应为可逆反应，并以焦磷酸代替ATP，在光合作用碳代谢中起重要作用。

PFP催化6-磷酸果糖转化为1,6-二磷酸果糖，它在醛缩酶和磷酸丙糖异构酶的作用下转变为磷酸二羟丙酮，再由α-磷酸甘油脱氢酶和NADH催化生成3-二磷酸甘油和NAD，340nm处的吸光度变化反映了PFP的活性的高低。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.试剂二：临用前加2.5ml蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存两周，禁止反复冻融。

2.试剂三：临用前加2.5ml蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存两周，禁止反复冻融。

3.试剂四：临用前取1支加入0.3ml蒸馏水溶解，4℃保存一周。(1支粉剂溶解后可做100T，为了延长使用时间，此产品多给1支粉剂)

4.试剂五：临用前加入0.3ml蒸馏水溶解，-20℃分装保存两周，禁止反复冻融。

5.试剂六：临用前加入0.3ml蒸馏水溶解，4℃保存一周，也可按比例现用现配。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。

操作步骤：

一、样品处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

1.组织：按照质量(g)：提取液体积(ml)为1：5～10的比例(建议称取约0.1g，加入1ml提取液)加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，20000g离心15min，取上清置冰上待测；

2.细胞：按照细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为500～1000：1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3min)；然后4℃，20000g离心15min，取上清置冰上待测；

3.液体：直接检测。

二、测定操作

1.分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2.操作表：

三、焦磷酸：

果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶活性的计算

1.按微量石英比色皿计算：

(1)按照样本蛋白浓度计算酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(V样×Cpr)÷T=53.59×ΔA÷Cpr

(2)按照样本质量计算酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(W×V样÷V提取)÷T=53.59×ΔA÷W

(3)按照细胞数量计算酶活单位定义：每104个细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP(U/10⁴cell)= ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(V样×细胞数量÷V提取)÷T=53.59×ΔA÷细胞数量

(4)按照液体体积计算酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 PFP(U/ml)=ΔA÷(ε×d)×V反总×10⁹÷V样÷T=53.59×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02ml；V提取：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，30min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/ml；W：样本质量，g；109：换算系数，1mol=109nmol。

2.按96孔UV板计算：

将上述公式中的d=1cm修改为d-0.6cm(96孔UV板光径)进行计算即可。

注意事项：

每次检测样本数不宜太多以免耽误过多的酶促反应时间。