正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

羟甲基戊二酰辅酶 A合成酶是甲羟戊酸代谢途径中的关键酶，催化乙酰 CoA与乙酰乙酰 CoA生成羟甲基戊二酰 CoA。

测定原理

HMGCS催化乙酰 CoA与乙酰乙酰 CoA生成羟甲基戊二酰 CoA，同时产生 CoASH，使 DTNB转化为黄色的 TNB，在 412nm下有特征吸光值。

所需的仪器和用品

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1瓶，-20℃避光保存；临用前加入 3mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存；临用前加入 3mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂三：6mL×1瓶，4℃避光保存。

样本测定的准备

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1mL提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次)；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清(浆)样品：直接检测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。

2、在微量石英比色皿或 96孔板中加入 25μL试剂一、25μL试剂二和 50μL试剂三，混匀，加入 100μL样本上清，迅速混匀后记录 412nm下初始吸光值 A1和 4min后的吸光值 A2。计算 ΔA＝A2-A1。

用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(浆)活性

单位定义：每 mL血清(浆)每分钟催化产生 1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T=36.76×ΔA

2、组织、细菌或细胞 HMGCS活性

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg组织蛋白每分钟催化产生 1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=36.76×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义：每 g组织每分钟催化产生 1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=36.76×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位定义：每 1万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/104 cel)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.074×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴ L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1  mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，4 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

用 96 孔板测定的计算公式如下

1、血清(浆)活性

单位定义：每 mL血清(浆)每分钟催化产生 1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T=73.53×ΔA

2、组织、细菌或细胞 HMGCS活性

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg组织蛋白每分钟催化产生 1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=73.53×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义：每 g组织每分钟催化产生 1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=73.53×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位定义：每 1万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmolTNB为一个酶活力单位。

HMGCS(nmol/min/104 cel)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.147×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴ L/ mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.1  mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，4 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。