正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

肉毒碱棕榈酰转移酶是存在于线粒体内膜的一类酰基转移酶。可逆地催化从酰基辅酶 A将酰基转移至 L-肉毒碱的反应，在转运脂肪酸通过线粒体内膜的过程中起重要作用。

测定原理：

基于肉碱和脂酰辅酶 A在丙二酰辅酶 A存在与否的条件下，通过肉碱脂酰转移酶(CPT-I)的作用，产生脂酰肉碱，并释放出巯基辅酶 A(COA-SH)，与 Ellman试剂 DN-TB反应后，产生黄色的 TNB。通过其吸收峰值得变化(412nm)，来定量分析 CPT-1的活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

试剂组成和配制：

试剂一：液体 100mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体 20mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 1.5mL×1支，-20℃保存；

试剂四：液体 30mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

①称取约 0.1g组织或收集 500万细胞，加入 1mL试剂一和 10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②将匀浆液于 600g，4℃离心 5min。

③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

④上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CPT-1(此步可选做)。

⑤在步骤④的沉淀中加入 200uL试剂二和 2uL试剂三，超声波破碎(冰浴，功率 20%或200W，超声 3秒，间隔 10秒，重复 30次)，用于线粒体 CPT-1测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)在试剂五中加入 1mL无水乙醇，混匀，再加入 22mL试剂四，混匀，37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

(2)在试剂六中加入 1mL蒸馏水，混匀，37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

(3)在微量石英比色皿或 96孔板中加入 10μL样本、220μL试剂五和 10μL试剂六，混匀，记录 412nm处 20秒时的初始吸光度 A1和 2分 20秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。

CPT-1活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CPT-1(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=880×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CPT-1(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T=177.8×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CPT-1(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.3556×ΔA

V反总：反应体系总体积，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴ L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。

b.使用 96孔板测定的计算公式如下：

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CPT-1(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=1760×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CPT-1(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=355.6×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

CPT-1(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.711×ΔA

V反总：反应体系总体积，2.4×10^-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴ L/ mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL； T：反应时间，2  min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。