正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中 MDH是 TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中 MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为 NAD-依赖的 MDH和 NADP-依赖的 MDH，细菌中通常只含有 NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。

测定原理：

MDHm催化 NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致 340nm处光吸收下降。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：100mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：20mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：1.5mL×1支，-20℃保存；

试剂四、液体 20 mL×1瓶，在 4℃保存；试剂五、粉剂×1瓶，-20℃保存；

样本测定的准备：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、称取约 0.1g组织或收集 500万细胞，加入 1mL试剂一和 10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆液于 600g，4℃离心 5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 MDH(此步可选做)。

5、在步骤④的沉淀中加入 200uL试剂二和 2uL试剂三，超声波破碎(冰浴，功率 20%或200W，超声 3秒，间隔 10秒，重复 30次)，用于 MDHm活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、检测工作液的配制：用时在试剂五中加入 19mL试剂四和 0.5mL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、测定前将检测工作液在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min以上。

4、在微量石英比色皿或 96孔板中加入 5μL样本和 195μL工作液，混匀后立即记录 340nm处 20s时的吸光值 A1和 1min20s后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=6430×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T =1299×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(2000×V样÷V样总)÷T=0.65×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.005 mL；V样总：加入提取液体积，0.202mL； T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；2000：细胞或细菌总数，2000万。

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=12860×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T =2598×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(2000×V样÷V样总)÷T=1.3×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.005 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL； T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；2000：细胞或细菌总数，2000万。