正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

苹果酸合酶(MS，EC 4.1.3.2)是属于转移酶中酰基转移酶的一类，主要存在于植物和微生物中。MS是乙醛酸循环的关键酶之一，在 MS催化下乙醛酸与乙酰辅酶 A反应生成苹果酸。

测定原理：

MS催化乙酰 CoA和乙醛酸产生苹果酸，同时生成辅酶 A，辅酶 A使无色的 DTNB转变成黄色的 TNB，在 412nm处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96孔板、研钵、冰、和蒸馏水

试剂组成和配制：

试剂一：液体 120 mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体 10 mL×1瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入 10mL试剂一充分溶解后使用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入 2.4mL试剂一充分溶解后使用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个)：试剂一体积(mL)为 500～1000：1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1mL试剂一)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次)；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL试剂一)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、酶标仪预热 30min以上，调节波长至 412nm。

2、样本测定

在 96孔板中依次加入 20μL样本、80μL试剂二，80μL试剂三和 20μL试剂四，混匀，立即记录 412 nm处反应 5min时的吸光值 A1和 10min时的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

MS活性计算：

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MS(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=294×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MS(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=294×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MS(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.588×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4  L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴  L/ mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。