测定原理:
谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GDH)催化 NH4+、α-酮戊二酸和 NADH,生成谷氨酸和 NAD+
,引起 340nm 吸光度值下降;通过测定 340nm 处吸光度的下降速率,计算 GDH 活性。
自备仪器或用品:
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml 石英比色皿、研钵、蒸馏水。
粗酶液提取:
粗酶液提取详见试剂盒内说明书。测定组织和细胞同时需要测定蛋白浓度。
操作步骤:
1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、样本测定:
(1) 工作液配制:将试剂二中加入试剂一 50ml 混合溶解,置于恒温水浴锅预温(哺乳动物 37°C;非哺乳动物25°C)5min,现用现配。
(2) 测定:取 0.95ml 工作液和 0.05ml 待测粗酶液于试管中,混匀并立即转入 1ml 比色皿,于波长 340nm 测得 20 秒时吸光度值 A1 和 5 分钟 20 秒时的吸光度值 A2,计算△A=A1-A2。(将样本加入工作液中即进行计时)