1 实验部分
1.1 仪器与试剂
LC1620A 高效液相色谱仪(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);
FA2004 电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);
甲醇(色谱纯,美国Tedia),维生素A 标准品(纯度>95%,阿拉丁试剂)。
1.2 标准溶液的配制
参考GB/T 17817-2010 饲料中维生素A 的测定高效液相色谱法,配制浓度为3.44μg/ml 的标准工作液。
1.3 色谱条件
色谱柱:Shodex C18-100-4D(4.6×150mm)
流动相:甲醇:水(95:5)
流速:1.0ml/min
柱温:室温
进样量:20μl
检测波长:326nm
2 实验结果
2.1 精密度
将1.2 中所配制的3.44μg/ml 标准溶液,在1.3 描述的高效液相色谱条件下进样,重复进样五次,结果如表1 所示RSD 均在1.0%以内。
表1 精密度实验结果
No | 保留时间 | 峰高 | 峰面积 |
1 | 5.493 | 66.302 | 725.623 |
2 | 5.468 | 66.832 | 712.594 |
3 | 5.463 | 66.948 | 713.915 |
4 | 5.472 | 66.631 | 714.214 |
5 | 5.489 | 66.102 | 716.8 |
平均值 | 5.477 | 66.563 | 716.629 |
RSD | 0.24% | 0.53% | 0.73% |
图1 标准品谱图
2.2 标准曲线
将1.2 中所配制的标准待测溶液逐级稀释为1.29μg/ml、0.86μg/ml、0.43μg/ml、0.07μg/ml 不同浓度,在1.3 描述的高效液相色谱条件下由低浓度开始进样,所得标准曲线结果如下:
2.3 实际样品测定
参考GB/T 17817-2010 第一法皂化提取法对饲料样品进行处理,具体步骤如下:
1、皂化:称取试样5g,置于250ml圆底烧瓶中,加入50ml的L-抗坏血酸乙醇溶液(5g/L),使试样完全分散、浸湿,加10ml氢氧化钾溶液(500g/L),摇匀。置于沸水浴中回流30min,不时振荡。皂化结束后,分别用5ml无水乙醇、5ml水自冷凝管顶端冲洗,取出烧瓶冷却至40℃;
2、提取:定量转移全部皂化液于盛有100ml二氯甲烷的500ml分液漏斗中,用50ml水分3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗,加盖、放气、随后混合,激烈振荡2min,静置、分层。同样操作三次,合并二氯甲烷相。用水100mL 洗涤二氯甲烷提取液至中性。后用无水硫酸钠脱水,转移至250ml棕色容量瓶中,加100mgBHT 溶解,用二氯甲烷定容至刻度。
3、浓缩:从二氯甲烷提取液中分取10ml,氮吹浓缩至近干。残渣以甲醇溶解,定容至1ml。用甲醇稀释100倍,经0.45μm滤膜过滤,作为待测样品溶液。
待测溶液在1.3 描述的高效液相色谱条件下进样,所得结果如下:
待测溶液 | 峰面积 | 浓度(μg/ml) |
标准品 | 739.327 | 3.44 |
样品 | 893.989 | 4.16 |
按称量样品量及稀释倍数计算得实际样品含量为2.08×103mg/kg。
图2 实际样品谱图
3 结论
采用LC1620A 高效液相色谱仪,参考GB/T 17817-2010 的方法对维生素A 进行分析,分析精密度与线性关系结果良好,并对实际样品进行分析,分离检出良好,符合国家标准的分析需要。