磷脂酶A2(EC₃.1.1.4)是磷脂sn-2位脂酰基水解酶，广泛存在于动植物组织、细菌、细胞核分泌物中，参与脂肪消化，精子成熟、细胞信号传递、脂质过氧化修复、宿主反应等生理过程，在控制体内磷脂类物质平衡、调节机体新陈代谢、参与疾病的病理进程等方面发挥着及其重要的作用。

磷脂酶A2作用于2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱(HEPC)产生游离巯基，与DTNB反应生成黄色物质，在412nm处有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

提取液：液体100ml×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体100ml×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体20ml×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体×5瓶，-20℃避光保存。临用前根据用量每瓶加入1.8ml试剂二充分混匀；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

所需的仪器和用品：

天平、超速冷冻离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板

操作步骤:

一、样品处理：

1.组织：按照质量(g)：提取液体积(ml)为1：5～10的比例(建议称取约0.1g，加入1ml提取液)加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1ml试剂一。

2.细胞：按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500～1000：1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min)；然后于4℃，10000g离心5min，取全部上清于4℃、100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1ml试剂一。

3.血清:直接测定。

二、测定步骤

三、计算公式:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/mg prot)=A÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T=73.53×△A÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义:每克组织每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/g鲜重)=△A÷(ε×d)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T= 73.53×△A÷W

3.细胞数量计算

酶活性定义:每104个细胞每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/104cel1)=△A÷(ε×d)×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T=73.53×△A÷细胞数量

4.按照液体体积计算

酶活性定义：每毫升血清每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/ml)=△A÷(ε×d)×V反总÷V样÷T=73.53×△A

ε：TNB消光系数，13600L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm； V反总：反应总体积，Iml；V样：反应体系中加入样本体积，0.1ml； W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1ml； T：反应时间，10min

b.用96孔板测定的计算公式如下

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/mg prot)= AA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T=147.06×△A÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/g鲜重)= △A÷(ε×d)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=147.06×△A÷W

3.细胞数量计算

酶活性定义:每104个细胞每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/104cel1)=△A÷(ε×d)×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T=147.06×△A÷细胞数量

4.按照液体体积计算

酶活性定义:每毫升血清每分钟水解HEPC产生1nmol游离巯基所需的酶量为一个酶活力单位。

PLA2活性(nmol/min/ml)=△A÷(ε×d)×V反总÷V样÷T= 147.06×△A

ε：TNB消光系数，13600L/mol/cm；d：比色皿光径，0.5cm； V反总：反应总体积，1ml；V样：反应体系中加入样本体积，0.1ml； W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1ml； T：反应时间，10min