注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

磷脂酶 D(EC 3.1.4.4)即磷脂酰胆碱水解酶，是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中，具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。

磷脂酶 D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将 4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在 500nm处有特征吸收峰。

产品内容：

溶液的配制：

1.试剂三：临用前加 1ml无水乙醇充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

需自备的仪器和用品：

天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。

操作步骤：

一、酶液提取

1.组织：按照质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g，加入 1ml提取液)加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g离心 30min，弃上清，取沉淀溶于1ml试剂一。

2.细胞：按照细胞数量(10⁴个)：提取液体积(ml)为 500～1000：1的比例(建议 500万细胞加入 1ml提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声  3秒，间隔 7秒，总时间 3min)；然后于 4℃，10000g离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g离心 30min，弃上清，取沉淀溶于 1ml试剂一。

3.血清：直接测定。

二、测定操作

三、酶活计算公式

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/mg prot)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷Cpr÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/g鲜重)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷W÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷W

3.按照细胞数量计算

酶活性定义：每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/10⁴cell)= (A测定管÷A标准管)×C标准÷细胞数量÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/ml)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)

C标准：标准品浓度，500nmol/ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g/ml；T：反应时间，30min。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1.按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/mg prot)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷Cpr÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/g鲜重)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷W÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷W

3.按照细胞数量计算

酶活性定义：每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/10⁴ cell)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷细胞数量÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。

PLD活性(nmol/min/ml)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)

C标准：标准品浓度，500nmol/ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g/ml；T：反应时间，30min。

注意事项：

1.显色完成后，若有沉淀，于8000rpm，25℃离心5min后取上清测定。

2.吸光值不宜超过1，否则用试剂一将酶液进行稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。