土壤总磷包括有机磷和无机磷，其中无机磷能够直接被植物利用。土壤有机磷经过矿化分解而转化为无机磷。同时测定土壤总磷、有机磷和无机磷，可以全面反映土壤磷营养状况。

利用钼蓝法定磷。取一份土样，通过浸提法测定土壤无机磷含量；另外取一份土样，经高温灼烧后，土壤有机磷转化为无机磷，测得土壤总磷含量；总磷含量减去无机磷含量，即可计算出有机磷含量。

技术指标：

最低检出限：0.3932μg/ml

线性范围：1-400μg/ml

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1.试剂三：临用前配制，加入8ml蒸馏水，充分溶解后加入4ml试剂二，混匀；

2.标准品：40μg/ml无机磷标准品。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、可调式水浴锅、分析天平、可调式移液器、550℃高温电炉、研钵、蒸馏水、30-50目筛、100目筛。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

1.无机磷：称取通过30-50目筛子的风干土样0.01g，转移到1ml离心管，加入1ml试剂一，震荡混匀，然后置于45℃水浴1h，8000rpm，离心10min，取上清液一，用于无机磷含量测定。

2.总磷提取：取通过100目筛子的风干土样，550℃灼烧1h，冷却后称取约0.01g，转移到1ml离心管，加入1ml试剂一，震荡混匀，然后置于45℃水浴1h，8000rpm，离心10min，取上清液二，用于总磷含量测定。

二、测定步骤

1.分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到660nm，蒸馏水调零。

2.打开水浴锅，调节温度到40℃。

3.空白管：取EP管，依次加入100μL蒸馏水，100μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min，室温冷却10min后于660nm测定吸光度，记为A空白管。

4.标准管：取EP管，依次加入10μL标准液，90μL蒸馏水，100μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min，室温冷却10min后于660nm测定吸光度，记为A标准管。

5.测定管：取EP管，依次加入10μL上清液一或者上清液二，90μL蒸馏水，100μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min，室温冷却10min后于660nm测定吸光度，记为A测定管。

三、土壤磷含量计算

1.土壤无机磷含量(μg/g土样)=[C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V总÷W=40×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷W

C标准液：40μg/ml；W：土壤样本质量，g；V总：上清液一总体积，1ml。

2.土壤总磷含量(μg/g土样)=[C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V总÷W=40×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷W

C标准液：40μg/ml；W：土壤样本质量，g；V总：上清液二总体积，1ml。

3.土壤有机磷(μg/g土样)=土壤总磷-土壤无机磷

注意事项:

1.试剂三配制过程中，可能会产生黑色固体，其不影响结果，注意吸取时不要将黑色固体吸入。

2.如果吸光值大于 1时，样本需用蒸馏水做相应稀释。

3.空白管和标准管只需测定 1-2次。

4.需在 40min内完成比色。