植物叶绿体中磷酸丙糖异构酶是光合作用中参与calvin循环的重要酶。作用于磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮之间的转化，磷酸二羟丙酮能快速透过叶绿体的包膜进入细胞质，并在其中逐步转化为蔗糖。

磷酸丙糖异构酶将磷酸二羟丙酮转化为3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛与NAD在3-磷酸甘油醛脱氢酶的作用下生成3-磷酸甘油酸和NADH，340nm处的吸光度变化反映了磷酸丙糖异构酶的活性的高低。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

提取液一：液体100ml×1瓶，4℃保存。

提取液二：液体100ml×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体12ml×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加2ml蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加2ml蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：粉剂×1瓶，-20℃避光保存。临用前加2ml蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

需自备的仪器和用品：

天平、低温离心机、研钵、震荡仪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板。

酶液提取:

1.总TPI酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1ml提取液一，冰浴匀浆后超声破碎(冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min)，然后4℃，8000g离心10min，取上清测定。

2.胞浆和叶绿体TPI酶的分离：按照植物组织质量(g)：提取液体积(ml)为1：5～10的比例(建议称取约0.1g样本，加入1ml提取液一)，冰浴匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆TPI酶活性，取沉淀加1ml提取液二，震荡溶解后超声破碎(冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间1min)，然后4℃，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中TPI酶活性。建议测定总TPI酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的TPI，则按照步骤②提取粗酶液。

操作步骤：

1.分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2.取微量石英比色皿/96孔板，依次加入120μL试剂一，20μL试剂二，20μL试剂三，20μL试剂四，20μL粗酶液，充分混匀，记录340nm处10s的吸光值A1和310s的吸光值A2，△A=A2-A1。

注意事项：

(1)按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

TPI(nmol/min/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr

(2)按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

TPI(nmol/min/g鲜重)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W ×V样÷V样总)÷T=321.54×ΔA÷W

V反总：反应体系总体积，0.2ml；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.02ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g 。

(1)按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

TPI(nmol/min/ mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T= 643.08×ΔA÷Cpr

(2)按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

TPI(nmol/min/g鲜重)= ΔA÷(ε×d)×V反总÷(W ×V样÷V样总)÷T=643.08×ΔA÷W

V反总：反应体系总体积，0.2ml；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/ mol/cm；d：比色皿光径，0.5cm； V样：加入样本体积，0.02ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，5min；Cpr：样本蛋白质浓度,mg/ml； W：样本质量，g