土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性的高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。土壤磷酸酶受到土壤碳、氮含量、有效磷含量和pH显著影响。通常按照其最适pH范围，分为碱性、中性和酸性三种类型磷酸酶。

碱性环境中，S-AKP/ALP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，通过测定酚的生成量即可计算出S-AKP/ALP活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1.试剂二：临用前加50ml蒸馏水充分溶解。

2.试剂四：临用前加1152μL无水乙醇(自备)，48μL蒸馏水充分溶解。(变褐色后不能再使用)

3.标准品：0.5μmol/ml苯酚标准液。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、1ml玻璃比色皿、台式离心机、37℃恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、研钵、蒸馏水、乙醇和甲苯(不允许快递)。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

称取风干混匀土壤约0.1g，加入0.05ml甲苯(自备)，轻摇15min；加0.4ml试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h；到时后迅速加入1ml试剂二充分混匀，以终止酶催化的反应。10000rpm室温离心10min，取上清液置于冰上待测。

二、测定步骤

1.分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm，蒸馏水调零。

2.空白管：取1ml玻璃比色皿，加入50μL试剂一，100μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830μL，混匀后室温静置30min，于660nm测定吸光度，记为A空白管。

3.标准管：取1ml玻璃比色皿，加入50μL标准液，100μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830μL，混匀后室温静置30min，于660nm测定吸光度，记为A标准管。(空白管和标准管只需要测定1-2次)

4.测定管：取1ml玻璃比色皿，加入50μL上清液，100μL试剂三，20μL试剂四，充分混匀，显色后再加蒸馏水830μL，混匀后室温静置30min，于660nm测定吸光度，记为A测定管。

三、S-AKP/ALP活性计算

活性单位定义：37℃中每克土壤每天释放 1nmol酚为 1个酶活单位。

S-AKP/ALP(U/g土样)=[C标准液×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)]×V总÷W÷T×1000=725×(A测定管-A空白管)÷(A标准管-A空白管)÷W

C标准液：0.5μmol/ml；V总：催化体系总体积，1.45ml；W：土壤样本质量，g；T：催化反应时间，24h=1d；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol。

相关发表文献：

[1] Liu B, Wang S, Wang J, et al. The great potential for pHytoremediation  of abandoned tailings  pond using ectomycorrhizal Pinus sylvestris[J]. Science of The Total Environment, 2020, 719: 137475.

[2] Shao T, Zhao J J, Liu A, et al. Effects of soil pHysicochemical properties on microbial communities in different ecological niches in coastal area[J]. Applied Soil Ecology, 2020: 103486.

参考文献：

[1]关松荫.土壤酶及其研究法[M].北京：科学出版社，1982