产品内容：

溶液的配制：

1.试剂一：临用前每瓶加入5ml双蒸水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。

2.标准品：5μmol/ml的对硝基苯酚溶液。

产品说明：

β-GAL(EC 3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。

β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

1.细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为500～1000：1的比例(建议500万细菌或细胞加入1ml提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次)；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2.组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为1：5～10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液)，进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤：

1.分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。

2.标准液的处理：用蒸馏水将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/ml。

3.样本测定(在EP管中依次加入下列试剂)：

三、β-GAL活性计算：

1.标准曲线的建立：根据标准管的吸光度(x，减去浓度为0的标准管OD值)和浓度(y，nmol/ml)建立标准曲线，将△A带入

标准曲线中，计算样品生成的产物量(nmol/ml)。

2.β-GAL活性计算：

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

β-GAL活力(nmol/h/mg prot)=(y×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=20×y÷Cpr

蛋白浓度需要另外测定。

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

β-GAL活力(nmol/h/g鲜重)＝(y×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=20×y÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

β-GAL活力(nmol/h/10⁴ cell)= (y×V反总)÷(500×V样÷V样总)÷T=0.04×y

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；V反总：反应体系总体积，0.5ml；V样：加入反应体系中样本体积，0.05ml；V样总：加入提取液体积，1ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万；T：反应时间，0.5h。