产品内容：

试剂一：液体35ml×1瓶，常温保存，若有黄色晶体析出，需加热溶解后再用；

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入20ml蒸馏水，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉至溶解。

标准品：粉剂×1支，10mg无水葡萄糖。

产品说明：

淀粉酶负责水解淀粉，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)从淀粉的非还原端切开α-1,4糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。

还原糖还原 3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐热。根据上述特性，钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、离心机、可调式移液器、96孔板/微量玻璃比色皿、研钵和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

称取约0.1g样本，加入0.8ml蒸馏水，研磨匀浆；将匀浆倒入离心管中，提取液在室温下放置提取15min，每5min振荡1次，使其充分提取；6000g，常温离心10min，取上清液加蒸馏水定容至10ml，摇匀，即淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液1ml，加入4ml双蒸水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于(α＋β)淀粉酶总活力的测定。

二、测定操作表：

1、可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、将葡萄糖标准液稀释为1、0.5、0.25、0.1325、0.0625、0.03425、0.015625、0.0078和0.0039mg/ml的标准溶液。

3、按操作表依次加入各试剂：

酶活性计算：

1、标准曲线的绘制

以∆A标准为y轴，以标准溶液浓度为x轴，绘制标准曲线，得到方程y=kx+b。将∆Aα测定带入方程得到x1(mg/ml)，∆A总代入方程得到x2(mg/ml)。

2、α-淀粉酶活性

(1)按照样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(mg/g鲜重)=x1×V样÷(W×V样÷V样总)÷T =2×x1÷W

(2)按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α-淀粉酶活性(mg/mg prot)=x1×V样÷(V样×Cpr)÷T = 0.2×x1÷Cpr

3、总淀粉酶活性计算

(1)按照样品质量计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性 (mg/g鲜重 )=5×x2×V样÷(W×V样÷V样总)÷T=10×x2÷W

(2)按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性(U/mg/mg prot)= 5×x2×V样÷(V样×Cpr)÷T = x2÷Cpr

4、β-淀粉酶活性计算

(1)按照样品质量计算

单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(U/g鲜重)＝淀粉酶总活性－α-淀粉酶活性=(10×x2÷W)-(2×x1÷W)=(10×x2-2×x1)÷W

(2)按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(U/mg prot)=淀粉酶总活性－α-淀粉酶活性=(x2÷Cpr)-(0.2×x1÷Cpr)

5、总淀粉酶稀释倍数:V样：加入反应体系中样本体积，0.075ml；V样总：提取液总体积，10ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；T：反应时间，5min。

注意事项：测定的吸光值大于1.5时，可以对样本进行适当稀释后测定。