淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-AL (EC 3.2.1.1)随机催化淀粉中α-1,4-糖苷键水解，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。淀粉水解酶催化淀粉水解生成还原糖，还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质，在540nm有吸收峰；通过测定540nm吸光度增加速率，计算淀粉酶活性。α-AL耐热，但是β-淀粉酶可在70℃钝化15min。因此粗酶液经过70℃钝化15min，就只有α-AL能够催化淀粉水解。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.试剂一：若有黄色晶体析出，需加热溶解后再用；

2.试剂二：临用前加入20ml蒸馏水，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉剂至溶解；

3.标准品：10mg无水葡萄糖。临用前加1ml蒸馏水，配成10mg/ml葡萄糖标准液。

需自备的仪器和用品：

酶标仪或可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、96孔板/微量玻璃比色皿、研钵/匀浆器和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

称取约0.1g样本，加0.8ml蒸馏水匀浆；匀浆后在室温下放置提取15min，每隔5min振荡1次，使其充分提取；6000g，室温离心10min，吸取上清液并且加蒸馏水定容至10ml，摇匀，即为淀粉酶原液。

二、测定步骤

1.分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，蒸馏水调零。

2.标准品的制备：将葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05mg/ml的标准溶液。

3.取250μL样本沸水浴5min作为对照管使用。

4.按照操作表依次加入各个试剂：

混匀，沸水浴10min，540nm处读取对照管、测定管、标准管、空白管吸光度，分别记为A对照、A测定、A标准和A空白，计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。

三、α-淀粉酶活性计算

1、标准曲线的绘制：以ΔA标准为y轴，以标准溶液浓度为x轴，绘制标准曲线，得到方程y=kx+b 。将ΔA测定带入方程得到x(mg/ml)。

2、 α-淀粉酶活性的计算：

(1)按照样本质量计算单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/g质量)=x×V样÷(W×V样÷V样总)÷T=2×x÷W

(2)按照蛋白质浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1m还原糖定义为1个酶活性单位。

α-淀粉酶活性(U/mg prot)= x×V样÷(V样×Cpr)÷T=0.2×x÷Cpr

V样：加入反应体系中样本体积，0.25ml；V样总：提取液总体积，10ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；T：反应时间，5min。

注意事项：

测定的吸光值大于1时，可以对样本进行适当稀释后测定。若吸光值过小，可以浓缩淀粉酶稀释液或者淀粉酶原液。