α-KGDH(EC 1.2.4.2)广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH，NADH在340nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品内容：

溶液的配制：

1.试剂八：临用前加入0.8 ml双蒸水充分混匀待用，用不完的试剂仍-20℃避光保存。

2.工作液的配制：临用前把试剂四、试剂五、试剂六、试剂七转移到试剂三中混合溶解待用。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤(仅供参考)：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

称取约0.1g组织或收集约500万细胞，加入1ml试剂一和10μL试剂二，冰浴用匀浆器或研钵充分研磨，4℃ 11000g离心10min，取上清，置冰上待测。

二、操作步骤

1.分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2.空白管：取200μL工作液加入微量石英比色皿或96孔板中，37℃孵育5min后取出比色皿，再依次加入8μL试剂八和12μL蒸馏水，混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A1，37℃准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A2，计算ΔA空白=A2-A1。

3.测定管：取200μL工作液加入微量石英比色皿或96孔板中，在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min后取出比色皿，再依次加入8μL试剂八和12μL样本，混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A3，37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)中准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A4，计算ΔA测定=A4-A3。

三、α-KGDH活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1.按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性(U/mg prot)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷(Cpr×V样)÷T=1473.7×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

2.按样本质量计算单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性(U/g质量)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷(V样÷V样总×W)÷T=1488.5×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

3.按细菌或细胞数量计算单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性(U/10⁴cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷(V样÷V样总×500)÷T=2.977×(ΔA测定-ΔA空白)

V反总：反应体系总体积，2.2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm； V样：加入样本体积，0.012ml；V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01ml；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

b.用96孔板测定的计算公式如下：

1.按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性(U/mg prot)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷(Cpr×V样)÷T=2456.2×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

2.按样本质量计算单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性(U/g质量)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷(V样÷V样总×W)÷T=2480.7×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

3.按细菌或细胞数量计算单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性(U/10⁴cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总×10⁹]÷(V样÷V样总×500)÷T=4.962×(ΔA测定-ΔA空白)

V反总：反应体系总体积，2.2×10^-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm； V样：加入样本体积，0.01ml；V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01ml；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

注意事项：

1.测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性和失活。

2.比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3.**两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4.测定管的ΔA值在0.01-0.25之间，若测定管的ΔA值大于0.25，需将样本进行稀释。

5.由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1mg/ml)，所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。