α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α-半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。

α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成：

溶液的配制：

1.试剂一：临用前每瓶加入5ml双蒸水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存；

2.标准品：5μmol/ml的对硝基苯酚溶液。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤(仅供参考)：

一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献)

1.细菌或培养细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每1000万细菌或细胞加入1ml提取液，超声波破碎细菌或细胞(功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次)，15000g，4℃，离心20分钟，取上清，置冰上待测。

2.组织的处理：称取约0.1g组织，加入1ml提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1.分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。

2.标准液的处理：用蒸馏水将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/ml。

3.样本测定(在1.5mlEP管中依次加入下列试剂)

三、α-GAL活性计算

1.标准曲线的建立：

根据标准管的吸光度(y，各标准管吸光值减去浓度为零的标准管的吸光值)和浓度(x，nmol/ml)建立标准曲线，将ΔA(y)带入标准曲线中，计算样本生成的产物量x(nmol/ml)。

2.α-GAL活性计算

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL活力(U/mg prot)=(x×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=20x÷Cpr蛋白浓度需要另外测定。

(2)按样本质量计算

单位的定义：每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL活力(U/g质量)=(x×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=20x÷W

(3)按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL活力(U/10⁴ cell)=(x×V反总)÷(1000×V样÷V样总)÷T=0.02x

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；V反总：反应体系总体积，0.5ml；V样：加入反应体系中样本体积，0.05ml；V样总：加入提取液体积，1ml；W：样本质量，g；1000：细胞或细菌总数，1000万；T：反应时间，0.5h。