正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

蔗糖是源(叶片等)光合产物向“库”器官运输的主要形态。蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13)是双向反应酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是蔗糖代谢的关键酶之一。研究其分解方向 SS-Ⅰ的活性对于植物蔗糖降解以及淀粉合成具有重要意义。

测定原理

SS-Ⅰ催化蔗糖和UDP生成游离果糖和UDPG，采用3,5－二硝基水杨酸法测定还原糖的含量来反映酶活性的高低。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰

试剂的组成和配制

提取液：液体 100ml×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 10ml×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体 5ml×1瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×2支，-20℃保存；临用前每支加入 1.2ml试剂二充分溶解待用，现配现用；

试剂四：液体 6ml×1瓶，4℃保存。

样品测定的准备：

按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1ml提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。

2、样本测定，(在 EP管中依次加入下列试剂)：

混匀，30℃准确水浴 30min后，95℃水浴 10min

95℃水浴 5min左右，冷却至室温

混匀，取 200μL至微量石英比色皿或 96孔板中，540nm下测定各管吸光值。ΔA=A测定-A对照。每个测定管需要设一个对照管。

SS-Ⅰ活性计算

1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.0012x - 0.0492；x为标准品浓度(μg/ml)，y为ΔA。

2、按照蛋白浓度计算

单位定义：每 mg组织蛋白每分钟催化产生 1μg还原糖定义为一个酶活力单位。

SS-Ⅰ活性(μg/min/mg prot)= (ΔA+0.0492)÷0.0012×V反总]÷(V样×Cpr)÷T=138.9×(ΔA+0.0492)÷Cpr

3、按照样本鲜重计算

单位定义：每 g组织每分钟催化产生 1μg还原糖定义为一个酶活力单位。

SS-Ⅰ活性(μg/min/g鲜重) =(ΔA+0.0492)÷0.0012×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=138.9×(ΔA+0.0492)÷W

b.用 96孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.0006x - 0.0492；x为标准品浓度(μg/ml)，y为ΔA。

2、按照蛋白浓度计算

单位定义：每 mg组织蛋白每分钟催化产生 1μg还原糖定义为一个酶活力单位。

SS-Ⅰ活性(μg/min/mg prot)= (ΔA+0.0492)÷0.0006×V反总]÷(V样×Cpr)÷T=277.8×(ΔA+0.0492)÷Cpr

3、按照样本鲜重计算

单位定义：每 g组织每分钟催化产生 1μg还原糖定义为一个酶活力单位。

SS-Ⅰ活性(μg/min/g鲜重) =(ΔA+0.0492)÷0.0006×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=277.8×(ΔA+0.0492)÷W

V反总：反应体系总体积，0.05ml； V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g。