正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

蔗糖酶(EC 3.2.1.26)是碳水化合物消化吸收的关键酶之一，能够水解蔗糖变成相应的单糖而被机体吸收。

测定原理：

本试剂盒采用 3.5－二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化产生的还原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。

所需的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、沸水浴、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 100ml×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 2ml×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1支 ，4℃保存，用时加入 1ml蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂 4℃保存；

试剂三：液体 3ml×1瓶，常温保存；

样品测定的准备：

按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1ml提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 520nm，蒸馏水调零。

2、样本测定，(在 EP管中依次加入下列试剂)：

置于 25℃准确水浴 10min

混匀， 95℃水浴 5min左右(盖紧，防止水分散失)，冷却至室温

混匀，取 200μL至微量石英比色皿或 96孔板中测定各管 520nm吸光值，ΔA=A测定-A对照，每个测定管需设一个对照管。

蔗糖酶活力计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定的回归方程为 y = 0.1296x -0.12；x为标准品浓度(mg/ml)，y为吸光值。

2、按照蛋白浓度计算

单位定义：每 mg组织蛋白每分钟催化水解 1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。

蔗糖酶活力(μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V₁]÷(V₁×Cpr)÷T=771×(ΔA+0.12)÷Cpr。

3、按样本鲜重计算

单位定义：每 g组织每分钟催化水解 1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。

蔗糖酶活力(μg/min/g鲜重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.1296×V₁]÷(W×V₁÷V₂)÷T=771×(ΔA +0.12)÷W。

b.用 96孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0648x -0.12；x为标准品浓度(mg/ml)，y为吸光值。

2、按照蛋白浓度计算

单位定义：每 mg组织蛋白每分钟催化水解 1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。

蔗糖酶活力 (μg/min/mg prot)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.0648×V₁]÷(V₁×Cpr)÷T=1542×(ΔA+0.12)÷Cpr。

3、按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织每分钟催化水解 1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。

蔗糖酶活力(μg/min/g鲜重)=[1000×(ΔA+0.12)÷0.0648×V₁]÷(W×V₁÷V₂)÷T=1543×(ΔA +0.12)÷W。

1000：1mg/ml=1000μg/ml；V₁：加入反应体系中样本体积，0.03ml；V₂：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，10min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本鲜重，g。