正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ICL(EC₄.1.3.1)主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL是乙醛酸循环的关键酶之一。

测定原理：

ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和 NADH在 LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在 340nm下有特征吸收峰，监测 340nm吸光度的减小速率可间接反应 ICL活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：

提取液：液体 100ml×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 15ml×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 360μL×1支，4℃保存；

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个)：提取液体积(ml)为 500～1000：1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1ml提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次)；15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1ml提取液)，进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)工作液的配置，将试剂二和试剂三转移至试剂一中，充分混合溶解，置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

(2)在试剂四中加入 4ml蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

(3)在微量石英比色皿或 96孔板中加入 10μL样本、150μL工作液和 40μL试剂四，混匀，立即记录 340nm处 20s时的吸光值 A₁和 2min20s后的吸光值 A₂，计算 ΔA=A₁-A₂。

ICL活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白中每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T=1608×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=3.215×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白中每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=3216×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3216×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=6.25×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。