正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ICDHc(EC 1.1.1.42)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化异柠檬酸脱氢脱羧生成 α-酮戊二酸，同时还原 NADP+生成 NADpH。ICDHc是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种 NADpH重要来源，在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。

测定原理：

利用 ICDHc催化 NADP+还原成 NADpH反应，在 340 nm下测定 NADpH浓度的增加。

所需的仪器和用品:

紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：60ml×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 50 ml×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1支，4℃保存；

试剂三：粉剂×1支，4℃保存；

试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；

样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个)：提取液体积(ml)为 500～1000：1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1ml提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次)；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1ml提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清(浆)样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、将试剂二转移至试剂一中充分溶解，置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴中预热 10min左右；用不完的试剂 4℃保存。

3、在试剂三中加入 550μL蒸馏水充分溶解，置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴中预热 10min左右；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

4、在试剂四中加入 550μL蒸馏水充分溶解，置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴中预热 10min左右；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

5、操作表：

将上述试剂按顺序加入 1 ml石英比色皿中，加样本的同时开始计时；混匀，在 340nm波长下记录 20s时的初始吸光度 A₁和 2min20s时的吸光度 A₂，计算 ΔA=A₂-A₁。

注意事项：

1、若 A₂-A₁大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，使 A₂-A₁小于 0.5，可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

2、若 A₂-A₁小于 0.005，可延长反应时间到 5min或 10min。

1、血清(浆)ICDHc活力的计算:

单位的定义：每 ml血清(浆)每分钟生成 1 nmol NADpH定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min/ml)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T=2143×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 ICDHc活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADpH定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=2143×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟生成 1 nmol NADpH定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T=2143×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol的 NADpH定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min/104)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=4.285×ΔA

V反总：反应体系总体积，8×10^-4 L；ε：NADpH摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。