正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

天冬酰胺合成酶是广泛存在于生物体内的一类氨基转移酶，催化谷氨酰胺的氨基向天冬氨酸转移。当植物处于氨毒时天冬酰胺的形成是一种解毒反应。

测定原理：

AS催化 L-天冬酰胺水解成 L-天冬氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其酶活性。

需自备仪器和用品：

台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 60mL×2瓶，4  ℃保存；

试剂二：粉剂×2瓶，4 ℃避光保存；临用前每瓶加入 25mL 蒸馏水充分溶解待用，现配现用；

试剂三：液体 60 mL×1瓶，常温保存；

试剂四：液体 5 mL×1瓶，常温保存；

试剂五：液体 3 mL×1瓶，常温保存；

试剂六：液体3 mL×1瓶，常温避光保存。

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个)：试剂一体积(mL)为 500～1000：1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1mL试剂一)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次)；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL试剂一)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清(浆)样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 420nm，蒸馏水调零。

2、样品测定(在 EP管中加入下列试剂)：

试剂名称(uL)	测定管	对照管
样本	25
蒸馏水		25
试剂一	100	100
试剂二	400	400

混匀，37℃水浴 1小时

试剂三

525

525

混匀，8000 g，25℃离心 10 min；取上清液，在 EP管或 96孔板中加入下列试剂

上清液	130	130
试剂四	30	30
试剂五	20	20
试剂六	20	20

混匀，室温静置 15min，420nm处读取测定管和对照管吸光值，计算 ΔA=A测定管-A对照管。对照管只要做一管。

注意：

1、试剂六如出现沉淀，静置后取上清使用。2、ΔA(A测定管-A对照管)若出现负值，可能是酶活性较低，可将反应时间 1h延长到2h，相应的在计算公式中除以 2。

酶活性计算：

标准条件下测定的回归方程为 y = 1.9244x + 0.0057，R² = 0.9983；x为标准品浓度(μmol/mL)，y为吸光值 A。

1、血清(浆)AS活性

单位定义：每 mL血清(浆)每 min催化谷氨酰胺生成 1nmol氨定义为一个酶活力单位。

AS (nmol/min/mL)＝ (ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总÷V样÷T×10⁰⁰=363.7×(ΔA -0.0057)

2、组织、细菌或细胞 AS活性

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每 mg蛋白质每 min催化谷氨酰胺生成 1nmol氨定义为一个酶活力单位。

AS (nmol/min/mg prot)＝ (ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总÷(V样×Cpr)÷T×10⁰⁰=363.7×(ΔA

-0.0057)÷Cpr。

(2)按样本鲜重计算：

单位定义：每 g组织每 min催化谷氨酰胺生成 1nmol氨定义为一个酶活力单位。

AS (nmol/min/g鲜重)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×10⁰⁰=363.7×(ΔA-0.0057)÷W。

(3)按细菌或细胞密度计算

单位定义：每 1万个细菌或细胞每 min催化谷氨酰胺生成 1nmol氨定义为一个酶活力单位。

AS  (nmol/min/104   cell) ＝ (ΔA-0.0057)÷1.9244×V反总÷(500×V样÷V样总 )÷T×10⁰⁰=0.7274×(ΔA -0.0057)

V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，60min；V反总：反应体系总体积，1.05mL； V样：加入反应体系中样本体积，0.025mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量， g；500：细菌或细胞总数，500万； 1000，μmol到 nmol换算系数。