正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase，CA)是一种含锌金属酶，迄今在哺乳动物体内已发现至少有11种同工酶，它们的结构、分布、性质各异，多与各种上皮细胞泌H-和碳酸氢盐有关，通过催化CO2水化反应及某些脂、醛类水化反应，参与多种离子交换 ，维持机体内环境稳态。

测定原理：

碳酸酐酶具有酯酶活性，可催化乙酸对硝基苯酯反应生成对硝基苯酚，通过检测 405nm处吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、水浴锅、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 20mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存；临用前加入 5mL试剂三，充分溶解待用，用不完的试剂继续-20℃避光保存。

试剂三：液体 6mL×1瓶，4℃保存。

样品测定的准备：

1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1mL提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复30次)；8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织的处理：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL提取液)，冰浴中匀浆。8000g  ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、酶标仪预热 30min，调节波长至 405nm。

2、试剂一、试剂二提前 25℃预热 10min。

3、取 96孔板，依次加入 20μL样本上清，140μL试剂一，最后加入 40μL试剂二。立刻混匀，测定 405nm下 3min处吸光值 A1与 6min处吸光值 A2，ΔA=A2-A1

CA活力计算：

标准条件下测定回归方程为 y = 1.0424x + 0.001，R² = 0.9994；x为标准品浓度(μmol/mL)，y为吸光值。

1、按照蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟催化产生 1nmol对硝基酚定义为一个酶活力单位。

CA活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.001)÷1.0424×V样÷(V样×Cpr)÷T×10⁰⁰=319.77×(ΔA-0.001)÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义：每 g组织每分钟催化产生 1nmol对硝基酚定义为一个酶活力单位。

CA活性(nmol/min/g鲜重)=(ΔA-0.001)÷1.0424×V样÷(W ×V样÷V样总)÷T×10⁰⁰=319.77×(ΔA-0.001)÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol对硝基酚定义为一个酶活力单位。

CA活性(nmol/min/10⁴ cell)=(ΔA-0.001)÷1.0424×V样÷(500 ×V样÷V样总)÷T×10⁰⁰=0.639×(ΔA-0.001)

V样：加入样本体积：0.02mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；T：反应时间，3min；1000，μmol到 nmol的换算系数。