正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

莽草酸途径是存在于植物、真菌和微生物中的一条重要的代谢途径，莽草酸脱氢酶是莽草酸合成途径中的关键酶。

测定原理：

莽草酸脱氢酶催化莽草酸和 NADP产生 NADPH，检测 340nm下的吸光值增加速率来表示SD活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 25mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1mL提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次)；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)在试剂二中加入 10mL试剂一充分溶解混匀，置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min，现配现用。

(2)在微量石英比色皿或 96孔板中加入 10μL样本和 190μL试剂二，混匀，立即记录 340nm处 20s时的吸光值 A1和 5min20s后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟产生 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

SD(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟产生 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

SD(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

SD(nmol/min/10⁴ cell)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.286×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4  L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³  L/  mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟产生 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

SD(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=1286×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟产生 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

SD(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T=1286×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

SD(nmol/min/10⁴ cell)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=2.572×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4  L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³  L/  mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。