正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

MCS广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，与柠檬酸合酶(CS)共同参与三羧酸循环的调节。

测定原理：

MCS催化丙酰 CoA和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅酶 A，进一步水解产生甲基柠檬酸；该反应促使无色的 DTNB转变成黄色的 TNB，在 412nm处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

试剂组成和配制：

试剂一：液体 50mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：液体 10mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 1mL×1支，-20℃保存；

试剂四：液体 50mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×2支，4℃保存，临用前加入 800μL无水乙醇；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂六：粉剂×4支，-20℃保存，临用前加入 400μL蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂七：粉剂×2支，-20℃保存，临用前加入 800μL蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

①称取约 0.1g组织或收集 500万细胞，加入 1mL试剂一和 10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②将匀浆 600g，4℃离心 5min。

③弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

④上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS(此步可选做)。

⑤在步骤④中的沉淀中加入 200uL试剂二和 2uL试剂三，超声波破碎(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3秒，间隔 10秒，重复 30次)，用于线粒体 CS测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。

2、将试剂四、五、六和七在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min。

3、样本测定

将上述试剂按顺序加入 1 mL玻璃比色皿中，加试剂七的同时开始计时，在 412nm波长下记录 20秒时的初始吸光度 A1和反应 2min后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=1100×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T=222.2×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min/10⁴ cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.4444×ΔA

V反总：反应体系总体积，9×10^-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×10⁴ L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。