注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AAO是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶”家族。细胞壁内的抗坏血酸和 AAO与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。AAO氧化 AsA所形成的 MDHA可通过质膜上的细胞色素 b还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长。

测定原理：

AAO可直接氧化 AsA，通过测定 AsA的氧化量，可计算得 AAO活力。

实验中所需仪器及设备：

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 100mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体 20mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×2瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL试剂一)进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

AAO测定操作：

1.分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 265 nm。

2.试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3.取 1瓶试剂三，加入 1mL蒸馏水充分溶解；配好的试剂三 3天内用完。

4.工作液的配制：将试剂二与试剂三按 170(μL)：10(μL)的比例混合，用多少配多少。

5.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入 20μL上清液、180μL工作液，迅速混匀后在 265nm测定 10s和 130s光吸收 A1和 A2，△A =A1-A2。

AAO活性计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1).按蛋白浓度计算

AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA为 1个酶活单位。

AAO(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(Cpr×V样)÷T= 92.4×△A÷Cpr

(2).按样本质量计算

AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol AsA为 1个酶活单位。

AAO(nmol/min/g鲜重) = △A÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(W×V样÷V样总)÷T= 92.4×△A÷W

ε：AsA在 265nm处摩尔吸光系数为 5.42×10⁴  L/mol/cm；d：比色皿光径(cm)，1 cm； V反总：反应体系总体积(L)，200μL=2×10^-4  L；10⁹：1mol=1×10⁹μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/mL)，需要另外测定，建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积(mL)，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL； T：催化反应时间(min)，2min。

b.使用 96孔板测定的计算公式如下

(1).按蛋白浓度计算

AAO活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA为 1个酶活单位。

AAO(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(Cpr×V样)÷T=184.8×△A÷Cpr

(2).按样本质量计算

AAO活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol AsA为 1个酶活单位。

AAO(nmol/min/g鲜重) = △A÷(ε×d)×V反总×10⁹÷(W×V样÷V样总)÷T= 184.8×△A÷W

ε：AsA在 265nm处摩尔吸光系数为 5.42×10⁴ L/mol/cm；d：96孔板光径(cm)，0.5 cm； V反总：反应体系总体积(L)，200μL=2×10^-4  L；10⁹：1mol=1×10⁹μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/mL)，需要另外测定，建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积(mL)，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL； T：催化反应时间(min)，2min。