产品介绍 注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。 测定意义 3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化 1，3-二磷酸甘油酸转变为 3-磷酸甘油酸，产生 1 分子 ATP，具有影响 DNA 复制和修补及刺激病毒 RNA合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。 测定原理 3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 产生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP，1,3-二磷酸甘油酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，340nm 处的吸 光度变化反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。 自备实验用品及仪器 天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板。 试剂组成和配制 提取液：液体 100mL×2 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。 试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂三：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加 1mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂四：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加 1 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 4 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。 酶液提取 ①总 PGK 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆后超声破碎(冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min)，然后 4℃，500g 离心 5min，取上清测定。 ②胞浆和叶绿体 PGK 酶的分离：按照植物组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10 的 比例(建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液)，冰浴匀浆后于 4℃，500g 离心 5min，弃 沉淀，取上清在 4℃，8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 PGK 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液，震荡溶解后超声破碎(冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min)，然后 4℃，500g 离心 5min，取上清测定叶绿体中 PGK 酶活性。 建议测定总 PGK 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 PGK， 则按照步骤②提取粗酶液。 测定操作 1.分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 2.取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 100μL 试剂一，20μL 试剂二，10μL 试剂三，10μL 试剂四，40μL 试剂五，20μL 粗酶液，充分混匀，记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s 的吸光值 A2，△A=A1-A2 计算公式 a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下 (1)按照样本蛋白浓度计算 酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 PGK(nmol/min /mg prot)＝ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr (2)按照样本质量计算 酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 PGK(nmol/min /g 鲜重)＝ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比 色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反 应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g b. 用 96 孔板测定的计算公式如下 (1)按照样本蛋白浓度计算 酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 PGK(nmol/min /mg prot)＝ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr (2)按照样本质量计算 酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 PGK(nmol/min /g 鲜重)＝ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643.08×ΔA÷W V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比 色皿光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反 应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g |
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