正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ACL(EC4.1.3.8)是脂肪酸合成中的关键酶，其催化产生的乙酰辅酶 A 可用于脂肪酸合成和碳链延长、黄酮类物质合成、氨基酸合成等。

测定原理：

ACL 在 ATP 和辅酶 A 存在的情况下催化柠檬酸裂解为乙酰辅酶 A、草酰乙酸、腺苷二磷酸和磷酸盐。苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和 NADH 生成苹果酸和 NAD+，在 340nm 测 定 NADH 减少速率，计算 ACL 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 2μL×1 支，4℃保存；

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴ 个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次)；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清(浆)样品：直接检测。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定

(1)工作液的配置，将试剂二和试剂三转移至试剂一中，充分混合溶解，置于 37℃(哺乳 动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min；(注意：可取少量试剂一至试剂二和试剂三中，充 分混匀溶解后转移至试剂一瓶中，重复 2-3 遍)；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复 冻融。

(2)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 工作液，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(浆)ACL 活力计算

单位定义：每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL(nmol/min/mL)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷V 样÷T=1608×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 ACL 活力计算

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL(nmol/min/g 鲜重)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=1608×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL(nmol/min/10⁴ cell)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=3.216×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总 数，500 万。

1、血清(浆)ACL 活力计算

单位定义：每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL(nmol/min/mL)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷V 样÷T=3216×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 ACL 活力计算

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL(nmol/min/g 鲜重)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=3216×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL(nmol/min/10⁴ cell)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=6.432×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：

96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总 数，500 万。