荧光偏振（FP）为基础的竞争性结合实验

实验采用氟化硼亚甲基二吡咯(BODIPY)标记的Geldanamycin类似物（BODIPY-AG）作为探针，根据探针与蛋白结合情况，测定荧光偏振。从HeLa细胞中分离活性人类Hsp90蛋白（α + β亚型）。以FP测定缓冲液(20 mM HEPES-KOH，pH 7.3，1.0 mM EDTA，100 mM KCl，5.0 mM MgCl2，0.01% NP-40，0.1 mg/mL新鲜牛γ-球蛋白（BGG），1.0 mM新鲜DTT以及溶于DMSO的蛋白酶抑制剂)新鲜制备BODIPY-AG溶液。将含BODIPY-AG和Hsp90的溶液（每组10 μL）与连续稀释的17-DMAG（使用FP测定缓冲液新鲜制备）混合，获得竞争性曲线。在384孔板中，各终浓度为10 nM BODIPY-AG，40或60 nM Hsp90，不同浓度的17-DMAG（0.10 nM ~ 10 μM）和≤ 0.25% DMSO。于30°C温育3小时后，使用EnVision 2100多标记酶标仪测定荧光各向异性（γEx = 485 nm，γEm = 535 nm）。由竞争曲线得出17-DMAG的IC50值。

细胞系

慢性淋巴细胞白血病(CLL)

制备方法

在DMSO中的溶解度大于10 mM。若配制更高浓度的溶液，一般步骤如下：请将试管置于37℃加热10分钟和/或将其置于超声波浴中震荡一段时间。原液于-20℃可放置数月。

反应条件

~ 1 μM；24或48小时

实验结果

在CLL细胞中，17-DMAG有效耗竭Hsp90客户蛋白，从而减少NF-κB p50/p65 DNA结合、NF-κB 靶基因转录以及caspase依赖性凋亡。通过靶向作用于NF-κB家族，17-DMAG选择性地作用于CLL细胞（呈剂量和时间依赖性），而不影响正常T细胞或NK细胞（在免疫监视中发挥重要作用）。

动物模型

移植TCL1白血病细胞的SCID小鼠

给药剂量

10 mg/kg；腹腔注射；每周5次，持续16天

实验结果

在TCL1-SCID移植小鼠模型中，给予17-DMAG（10 mg/kg）显著降低白细胞数，并延长生存期。

其他注意事项

请于室内测试所有化合物的溶解度。虽然化合物的实际溶解度可能与其理论值略有不同，但仍处于实验系统误差的允许范围内。

References:

[1]. Jie Ge, Emmanuel Normant, James R. Porter, Janid A. Ali, Marlene S. Dembski, Yun Gao, Asimina T. Georges, Louis Grenier, Roger H. Pak, Jon Patterson, Jens R. Sydor, Thomas T. Tibbitts, Jeffrey K. Tong, Julian Adams, and Vito J. Palombella. Design, synthesis and biological evaluation of Hydroquinone derivatives of 17-Amino-17-demethoxygeldanamycin as potent, water-soluble inhibitors of Hsp90. J. Med. Chem. 2006, 49, 4606-4615.

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