Cyclin/CDK 激酶实验

从经工程化以产生表达特定细胞周期蛋白或CDK的杆状病毒的Sf9细胞纯化重组细胞周期蛋白/CDK全酶。细胞周期蛋白/CDK复合物通常在含有50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），10 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT和0.1 mmol/L原钒酸钠的激酶反应缓冲液中稀释至终浓度为50 μg/mL。对于每个激酶反应，混合1 μg酶和20 μL 2 μmol/L底物溶液（来自组蛋白H1的生物素化肽，Amersham），并与10 μL稀释的SCH 727965组合。通过加入50 μL 2 μmol/L ATP和0.1 μCi 33P-ATP起始反应。在室温下孵育1小时，并通过加入0.1％Triton X-100、1 mmol/L ATP，5 mmol/L EDTA和5 mg/mL链霉亲和素包被的SPA来终止。使用96孔GF/B滤板和Filtermate通用收获器捕获SPA磁珠。磁珠用2 mol/L NaCl洗涤两次，用含有1％磷酸的2mol/L NaCl洗涤两次。然后使用Top-Count 96孔液体闪烁计数器测定信号。从抑制性化合物的重复，8点系列稀释物产生剂量反应曲线。通过非线性回归分析得到IC50值。

细胞系

A2780细胞

制备方法

溶解度有限。若配制更高浓度的溶液，一般步骤如下：请将试管置于37℃加热10分钟和/或将其置于超声波浴中震荡一段时间。原液于-20℃可放置数月。

反应条件

2 h

实验结果

SCH 727965在浓度大于6.25 nmol/L时显著废除Rb蛋白上Ser 807/811的磷酸化，并且引发p85 PARP裂解产物的生成。100 nmol/L SCH727965处理2小时可诱导Rb磷酸化和caspase活化的抑制，在6小时后仍可检测到。

动物模型

A2780卵巢癌小鼠异种移植模型

给药剂量

腹腔注射，8、16、32和48 mg/kg，每天

实验结果

腹腔注射8、16、32和48 mg/kg SCH 727965，给药10天后肿瘤抑制分别为70％、70％、89％和96％。SCH 727965具有良好的耐受性，最高剂量组的最大体重减轻为5％。

注意事项

请于室内测试所有化合物的溶解度。虽然化合物的实际溶解度可能与其理论值略有不同，但仍处于实验系统误差的允许范围内。

References:

1. Parry D, Guzi T, Shanahan F et al. Dinaciclib (SCH 727965), a novel and potent cyclin-dependent kinase inhibitor. Mol Cancer Ther. 2010 Aug;9(8):2344-53.