生化检测和高通量筛选

通过使用修饰的NADH-偶联实验监测反应中的ADP形成来评价重组野生型VCP及其突变体的ATP酶活性和动力学参数。由于ADP和NADH是VCP ATP酶活性的ATP竞争性抑制剂，将NADH偶联实验的标准方案改进为两步程序。在第一部分中，ATP再生系统（40U / ml丙酮酸激酶和3mM磷酸烯醇丙酮酸）再循环由VCP活性产生的ADP，保持底物浓度恒定（从而防止产物抑制），并累积化学计量的丙酮酸。在第二部分中，用30 mM EDTA和250 μM NADH淬灭VCP酶促反应，并通过40U / ml乳酸脱氢酶化学计量地氧化以减少积累的丙酮酸。使用Tecan Safire 2阅读板在340nm测量NADH浓度的降低。在具有50mM Hepes，pH 7.5，0.2mg / ml BSA，10mM MgCl 2和2mM DTT的反应缓冲液中，在96-孔或384-孔UV板中进行测定。实验数据用协同方程拟合，获得约60μM的Ks *和2.0±0.1的Hill系数（n）。使用1,536孔形式的微型化测定法和更灵敏的ADP检测系统Transcreener ADP FP对1百万化合物文库进行HTS筛选。进行10 nM VCP和10 μM抑制剂的20分钟预孵育，然后向反应中加入10μM ATP，在淬灭前使其反应90分钟。筛选的平均Z'为0.58，命中率使用3×s.d（38％抑制）作为截断值，为1.7％。在10μM浓度下具有> 60％抑制的初级命中使用物理化学和结构过滤器筛选，留下7,516种化合物。最后，对3,988个初次命中进行一式两份的重新确认，并且使用先前描述的NADH修饰的偶联实验选择500个化合物用于剂量反应评价。针对野生型VCP和C522T突变体测量HTS命中的效力。在测定中，使用针对野生型和C522T突变体产生半数最大速度（K s *）的ATP浓度分别为60 μM和130 μM。为了研究可逆抑制剂与底物浓度的相关性，在饱和ATP浓度（1 mM）下评价它们的效力，并与标准ATP竞争性抑制剂（AMP-PNP）的效力进行比较。

细胞系

HCT116、HeLa细胞

溶解方法

该化合物在DMSO中的溶解度 > 10 mM。若配制更高浓度的溶液，一般步骤如下：请将试管置于37℃加热10分钟和/或将其置于超声波浴中震荡一段时间。原液于-20℃可放置数月。

反应时间

0.5，2.5μM，6小时

应用

NMS-873活化未折叠蛋白反应，干扰自噬和诱导癌细胞死亡。NMS-873介导活细胞中Mcl-1的稳定。 NMS-873抑制HCT116和HeLa细胞的增殖活性，IC50分别为0.4和0.7μM。

References:

1Magnaghi, P., D'Alessio, R., Valsasina, B., Avanzi, N., Rizzi, S., Asa, D., Gasparri, F., Cozzi, L., Cucchi, U., Orrenius, C., Polucci, P., Ballinari, D., Perrera, C., Leone, A., Cervi, G., Casale, E., Xiao, Y., Wong, C., Anderson, D. J., Galvani, A., Donati, D., O'Brien, T., Jackson, P. K. and Isacchi, A. (2013) Covalent and allosteric inhibitors of the ATPase VCP/p97 induce cancer cell death. Nat Chem Biol. 9, 548-556