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EdU Flow Cytometry Assay Kits(Cy5)
本产品不向个人销售,仅用作科学研究,不用于任何人体实验及非科研性质的动物实验。
EdU Flow Cytometry Assay Kits(Cy5)图片
包装:100 tests
市场价:1000元

产品介绍

描述

测量细胞增殖和细胞周期是评估细胞健康,确定遗传毒性和评估药物药效的基本方法。这其中常用的方法是直接测量DNA的合成。在以往的实验中,有几种方法,例如掺入放射性核苷(3H-thymidine)或BrdU。在这里,我们介绍一种新方法,点击化学-CuAAC(铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应),以及该反应在直接测量细胞周期中S期DNA合成中的应用。 “点击化学”是K. B. Sharpless于2001年引入的一个术语,它是在生物连接中常用的一组具有生物相容性的小分子反应,允许将底物与特定生物分子(例如报道分子)结合在一起。

胸腺嘧啶核苷类似物,EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)可以在DNA合成过程中掺入DNA链中。 EdU的炔基是一种生物惰性基团,可以通过CuAAC反应与染料的叠氮基发生极强的选择性反应,从而生成1,2,3-三唑产物。 EdU和Cy3 / Cy5 azide具有生物学上独特的基团,连接后可以荧光标记增殖细胞的DNA,获得低背景的图像和高检测灵敏度。这种CuAAC反应可在极温和的条件下提供出色的区域选择性和定量转化。该反应是高效的,并且可以通过流式细胞术,荧光计或荧光显微镜以定量方式使用。

EdU是BrdU的理想替代品,因为它不受苛刻的DNA变性条件(通常使用HCl,加热或DNase消化)的影响。在基于BrdU的检测中,需要额外的DNA变性以使BrdU暴露于抗BrdU抗体,此抗体与基于EdU的检测中使用的荧光染料相比体积巨大。与巨大的抗体不同,炔基和叠氮基的体积非常小,因此Cy3 / Cy5叠氮化物在基于醛的标准固定和去污剂透化作用下就可以进入DNA。此外基于BrdU的测定后的样品,由于使用酸变性方法时,有可能破坏了抗原识别位点,导致细胞周期分布的信号改变。而基于EdU的测定与细胞周期染料兼容。 EdU分析还可以与一些针对表面和细胞内标记的抗体一起并用。但是,某些试剂或抗体偶联物可能与EdU检测反应不兼容,并且可能需要一些其他步骤来确保兼容性。

Cy3 azide (最大激发波长:555nm 最大发射波长: 570nm)

Cy5 azide (最大激发波长: 646nm 最大激发波长: 662nm)

组份和存储

EdU(Component A)20 mg
Cy5 azide(Component B)1 vial
DMSO(Component C)8.5 mL
CuSO4(100 mM aqueous solution)(Component D)1 mL
EdU buffer additive(Component E)400 mg

存放于-20°C。

保持干燥并避光。

特性

操作简单,花费时间更少,无需变性步骤或苛刻的处理

效率高,亮度高

与某些抗体和细胞周期染料兼容

由于不使用可变的抗BrdU抗体,因此具有很高的一致性

常见问题解答

1)Q:不同货号的EdU可以检测多少个样品?

A:EdU Imaging Kits(货号K1075与K1076)如果用于培养的细胞(6孔板)的检测,可以检测50个样品,每个样品的反应体系为500 μL的cocktail反应液;如果用于12孔、24孔、48孔,96孔,384孔板样品的检测,分别可以检测125、250、350、500、1250个样品,每个样品推荐的反应液用量为200 μL、100 μL、70 μL、50 μL、20 μL;
EdU Imaging Kits(货号K1075与K1076)如果用于冰冻或石蜡切片的检测,可以检测125-250个样品,每个样品的反应体系为100-200 μL的cocktail反应液。 EdU Flow Cytometry Assay Kits(货号K1077与K1078)如果用于流式细胞仪检测,可以检测100个样品,每个细胞样品的细胞数量宜为10-100万,每个样品的反应体系为500 μL的cocktail反应液。

2)Q:EdU可否用于动物体内注射?

A:EdU可以通过注射或进食等方式进行动物的体内标记。如以小鼠为例,可以按照10-200 mg/kg的用量,用PBS配制成一定浓度的EdU,腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中,4小时后或根据特定实验确定的适当时间后,快速处死小鼠,取出所需的组织,按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。具体用量跟所用动物的种类、体重和使用方式有关。

3)Q:能否在活细胞中进行Click EdU检测?

A:不可以。Click反应体系中的叠氮化物检测试剂和缓冲液组分是细胞非透过型,检测EdU信号时的Click反应必须在固定和通透的样品上进行。

4)Q:Cy3与Cy5有什么区别?

A:荧光基团不同,检测时发射荧光的颜色不同(Cy3 azide最大激发波长555 nm, 最大发射波长570 nm;Cy5 azide最大激发波长646 nm,最大激发波长662 nm),两者的实验效果相同,可根据个人需求进行选择。

5)Q:样本检测不到EdU阳性信号?

A:可能原因及解决方案如下:

a) 所用试剂可能变质,不要使用已经变黄的添加剂或缓冲液;

b) 确保样本发生增殖,可设置阳性对照以确认染色过程无误;

c) EdU处理时间太短,细胞实验一般EdU处理时间宜为细胞周期长度的1/5-1/10,阳性率约为20%-30%,动物实验一般根据目的组织细胞的增殖速度进行时间调整,若细胞增殖速度慢,可延长EdU处理时间;

d) 染色过程干片、固定和通透不充分等因素,实验操作要严谨。

6)Q:样本背景信号很强应该怎么处理?

A:可能原因包括:染色后洗涤不充分,可增加洗涤次数;染色过程中干片导致染料粘附严重;多聚甲醛固定时间过长;没有阳性信号而曝光过度导致背景严重等等,同时可以设置对照组(无染料或无Click反应)排除自发荧光干扰。