描述

测量细胞增殖和细胞周期是评估细胞健康，确定遗传毒性和评估药物药效的基本方法。这其中常用的方法是直接测量DNA的合成。在以往的实验中，有几种方法，例如掺入放射性核苷（3H-thymidine）或BrdU。在这里，我们介绍一种新方法,点击化学-CuAAC（铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应），以及该反应在直接测量细胞周期中S期DNA合成中的应用。 “点击化学”是K. B. Sharpless于2001年引入的一个术语，它是在生物连接中常用的一组具有生物相容性的小分子反应，允许将底物与特定生物分子（例如报道分子）结合在一起。

胸腺嘧啶核苷类似物，EdU（5-ethynyl-2’-deoxyuridine）可以在DNA合成过程中掺入DNA链中。 EdU的炔基是一种生物惰性基团，可以通过CuAAC反应与染料的叠氮基发生极强的选择性反应，从而生成1,2,3-三唑产物。 EdU和Cy3 / Cy5 azide具有生物学上独特的基团，连接后可以荧光标记增殖细胞的DNA，获得低背景的图像和高检测灵敏度。这种CuAAC反应可在极温和的条件下提供出色的区域选择性和定量转化。该反应是高效的，并且可以通过流式细胞术，荧光计或荧光显微镜以定量方式使用。

EdU是BrdU的理想替代品，因为它不受苛刻的DNA变性条件（通常使用HCl，加热或DNase消化）的影响。在基于BrdU的检测中，需要额外的DNA变性以使BrdU暴露于抗BrdU抗体，此抗体与基于EdU的检测中使用的荧光染料相比体积巨大。与巨大的抗体不同，炔基和叠氮基的体积非常小，因此Cy3 / Cy5叠氮化物在基于醛的标准固定和去污剂透化作用下就可以进入DNA。此外基于BrdU的测定后的样品，由于使用酸变性方法时，有可能破坏了抗原识别位点，导致细胞周期分布的信号改变。而基于EdU的测定与细胞周期染料兼容。 EdU分析还可以与一些针对表面和细胞内标记的抗体一起并用。但是，某些试剂或抗体偶联物可能与EdU检测反应不兼容，并且可能需要一些其他步骤来确保兼容性。

Cy3 azide (最大激发波长:555nm 最大发射波长: 570nm)

Cy5 azide (最大激发波长: 646nm 最大激发波长: 662nm)

组份和存储

特性

操作简单，花费时间更少，无需变性步骤或苛刻的处理

效率高，亮度高

与某些抗体和细胞周期染料兼容

由于不使用可变的抗BrdU抗体，因此具有很高的一致性

常见问题解答

1）Q：不同货号的EdU可以检测多少个样品？

A：EdU Imaging Kits（货号K1075与K1076）如果用于培养的细胞（6孔板）的检测，可以检测50个样品，每个样品的反应体系为500 μL的cocktail反应液；如果用于12孔、24孔、48孔，96孔，384孔板样品的检测，分别可以检测125、250、350、500、1250个样品，每个样品推荐的反应液用量为200 μL、100 μL、70 μL、50 μL、20 μL；
EdU Imaging Kits（货号K1075与K1076）如果用于冰冻或石蜡切片的检测，可以检测125-250个样品，每个样品的反应体系为100-200 μL的cocktail反应液。 EdU Flow Cytometry Assay Kits（货号K1077与K1078）如果用于流式细胞仪检测，可以检测100个样品，每个细胞样品的细胞数量宜为10-100万，每个样品的反应体系为500 μL的cocktail反应液。

2）Q：EdU可否用于动物体内注射？

A：EdU可以通过注射或进食等方式进行动物的体内标记。如以小鼠为例，可以按照10-200 mg/kg的用量，用PBS配制成一定浓度的EdU，腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中，4小时后或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需的组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。具体用量跟所用动物的种类、体重和使用方式有关。

3）Q：能否在活细胞中进行Click EdU检测？

A：不可以。Click反应体系中的叠氮化物检测试剂和缓冲液组分是细胞非透过型，检测EdU信号时的Click反应必须在固定和通透的样品上进行。

4）Q：Cy3与Cy5有什么区别？

A：荧光基团不同，检测时发射荧光的颜色不同（Cy3 azide最大激发波长555 nm， 最大发射波长570 nm；Cy5 azide最大激发波长646 nm，最大激发波长662 nm），两者的实验效果相同，可根据个人需求进行选择。

5）Q：样本检测不到EdU阳性信号？

A：可能原因及解决方案如下：

a) 所用试剂可能变质，不要使用已经变黄的添加剂或缓冲液；

b) 确保样本发生增殖，可设置阳性对照以确认染色过程无误；

c) EdU处理时间太短，细胞实验一般EdU处理时间宜为细胞周期长度的1/5-1/10，阳性率约为20%-30%，动物实验一般根据目的组织细胞的增殖速度进行时间调整，若细胞增殖速度慢，可延长EdU处理时间；

d) 染色过程干片、固定和通透不充分等因素，实验操作要严谨。

6）Q：样本背景信号很强应该怎么处理？

A：可能原因包括：染色后洗涤不充分，可增加洗涤次数；染色过程中干片导致染料粘附严重；多聚甲醛固定时间过长；没有阳性信号而曝光过度导致背景严重等等，同时可以设置对照组（无染料或无Click反应）排除自发荧光干扰。