激酶实验

通过使用Lipofectamine在HeLa细胞中转染Myc标记的重组ROCK-1、ROCK-II、PKN或citron激酶，并通过使用9E10单克隆抗Myc抗体偶联G蛋白琼脂糖凝胶从细胞裂解物中进行沉淀。在不存在或存在各种浓度的Y-27632下，将回收的免疫复合物与各种浓度的 [32P] ATP及10 mg组蛋白2作为底物一起温育，于总体积为30 mL激酶缓冲液中30°C反应30分钟，缓冲液包含50 mM HEPES-NaOH、pH 7.4、10 mM MgCl₂、5 mM MnCl₂、0.02％Briji 35和2 mM二硫苏糖醇。在不存在或存在各种浓度的Y-27632下，将PKCa与5 mM [32P] ATP和200 mg/ml组蛋白2作为底物，在30°C下在总体积为30 mL的激酶缓冲液中反应30 min，缓冲液配方为50 mM Tris-HCl、pH 7.5、0.5 mM CaCl₂，5 mM乙酸镁，25 mg/mL磷脂酰丝氨酸，50 ng/mL 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate和0.001％亮肽素。使用43 Laemmli样品缓冲液（10 mL）终止反应。

细胞系

HeLa细胞，Swiss 3T3细胞

溶解方法

该化合物在DMSO中的溶解度大于10 mM。若获取更高浓度的溶液，可在37°C下孵育10分钟，随后在超声波浴中摇匀。-20°C以下可储存数月

反应条件

0.3和1 μM, 30 min或24 h

应用

Y-27632抑制ROCK-1和ROCK-II的激酶活性，ATP以竞争性方式逆转了这种抑制作用。在Swiss 3T3细胞中，Y-27632（10 μM）消除了应激纤维，但在该浓度下，细胞周期的G1-S转变和胞质分裂几乎不受影响。在Swiss 3T3细胞中，Y-27632细胞预处理30分钟以浓度依赖性方式防止细胞形状及肌动蛋白应激纤维发生变化，在10 μM浓度下几乎完全抑制。10和100 μM的Y-27632延长了延迟时间，并以浓度依赖性方式将BrdU标记细胞的出现延迟约1和4小时。在HeLa细胞中，30 μM Y-27632抑制胞质分裂。

注意事项

由于实验环境的不同，实际溶解度可能与理论值略有不同，请测试室内所有化合物的溶解度。

References:

[1]. Ishizaki T, Uehata M, Tamechika I, et al. Pharmacological properties of Y-27632, a specific inhibitor of rho-associated kinases[J]. Molecular pharmacology, 2000, 57(5): 976-983.