ATR激酶检测

在由25 mM HEPES (pH 7.4)，2 mM MgCl2，250 mM NaCl，0.5 mM EDTA，0.1 mM Na3VO4，10% v/v甘油和0.01% v/v吐温20组成的缓冲液中，使用抗ATR 400 ~ 480的兔多克隆抗血清进行免疫沉淀，从HeLa细胞核中提取ATR，将其用于后续的体外酶测定。将核提取物与蛋白A-琼脂糖珠一起孵育1小时，然后通过离心回收珠子，最终分离出ATR-抗体复合物。在96孔板中，将10 μL含ATR的琼脂糖磁珠与1 μg谷胱甘肽S-转移酶置于ATR测定缓冲液（50 mM HEPES (pH 7.4)，150 mM NaCl，6 mM MgCl2，4 mM MnCl2，0.1 mM Na3VO4，0.1 mM DTT，以及10% (v/v) 甘油）中，于37°C下，在有或无抑制剂的环境下，将其孵育。轻轻摇晃10分钟后，加入ATP至最终浓度为3 μM，反应在37°C下持续1小时。加入100 μL PBS终止上述反应，再将反应混合物转移至包被了白色不透明谷胱甘肽的96孔板中，将其置于4℃中，孵育过夜。使用PBS/0.05% (v/v) 吐温20洗涤96孔板，将其吸干，使用磷酸丝氨酸15 p53抗体通过标准的ELISA技术进行分析。当检测磷酸化的谷胱甘肽S-转移酶- p53N66底物时，以结合了辣根过氧化物的山羊抗小鼠作为二抗。增强的化学发光溶液产生相应的信号，通过TopCount读板器可以检测化学发光。计算酶活性，结果以%表示，然后确定化合物的IC50值。

细胞系

BT-474细胞和HT29结直肠腺癌细胞

制备方法

在DMSO中的溶解度大于10 mM。若配制更高浓度的溶液，一般步骤如下：请将试管置于37℃加热10分钟和/或将其置于超声波浴中震荡一段时间。原液于-20℃可放置数月。

反应条件

60分钟

实验结果

在BT-474细胞中，AZ20抑制pAKT T308。在HT29细胞中，AZ20抑制pATM Ser-1981和pDNA-PK Ser-2056。在LoVo结直肠腺癌细胞中，AZ20抑制细胞生长，其GI50为0.20 μM.。

动物模型

携带LoVo肿瘤的雌性裸鼠

给药剂量

5 mg/kg，每日2次，以及50 mg/kg，每日1次；口服

实验结果

当剂量为10 μM时，AZ20抑制细胞色素3A4介导的Midazolam代谢。在低剂量的老鼠PK实验中， AZ20具有相当的生物利用度。

其它注意事项

请于室内测试所有化合物的溶解度。虽然化合物的实际溶解度可能与其理论值略有不同，但仍处于实验系统误差的允许范围内。

References:

[1]. Foote KM, Blades K, Cronin A et al. Discovery of 4-{4-[(3R)-3-Methylmorpholin-4-yl]-6- [1-(methylsulfonyl)cyclopropyl]pyrimidin-2-yl}-1H-indole (AZ20): a potent and selective inhibitor of ATR protein kinase with monotherapy in vivo antitumor activity. J Med Chem. 2013 Mar 14;56(5):2125-38.