| 包装: | 25 reactions |
| 市场价: | 1600元 |
HyperScribe(TM) Poly（A）Tailing Kit 使用大肠杆菌Poly（A）聚合酶（E-PAP）进行RNA体外转录的多聚腺苷酸化，转录产物至少添加150个核苷酸poly（A）尾部。聚腺苷酸化在真核生物增加RNA的稳定性中起重要作用，并可提高翻译起始效率。加帽和加尾后的mRNA与未修饰的mRNA相比，在显微注射和转染实验中其稳定性和翻译效率显著提高。
| 体积 | 组分 | 储存 |
| 100 μL | E-PAP (2 units/μL) | –20°C |
| 600 μL | 5X E-PAP Buffer | –20°C |
| 100 μL | ATP Solution (100 mM) | –20°C |
| 250 μL | 25 mM MnCl2 | –20°C |
| 1 mL x 2 | Nuclease - free Water | 适合温度* |
*在–20°C、4°C或室温下储存无核酸酶水。 | ||
1. 阳性对照反应
1. 用HyperScribeTM T7 High Yield RNA Synthesis Kit试剂盒转录2μL EGFP对照组模板，不要在转录反应中加入放射性标记的UTP示踪剂。
2. 按照T7 RNA合成试剂盒的中的方法，用DNase I处理转录本。
3. 根据第3部分的方法给转录本加poly(A)尾，但额外加入[α-32P] ATP（任何特异性都可以用）；通过跟踪放射性标签，可以更容易地检测出在终反应中有多少ATP结合到poly(A)尾中；记得在向反应混合液加入E-PAP之前吸取留样，作为无酶反应体系（阴性对照）。
4. 通过TCA沉淀法检测结合的带标记的RNA。（成功的加尾反应结合至少50%的放射性标签）
5. 取0.5μl的阳性对照反应液及相应的无酶反应液进行电泳（用2.5%的甲醛-琼脂糖凝胶），同时用RNA markers。
（加poly(A)尾的产物其电泳条带应该比无酶反应产物的条带大至少150碱基）
2. 凝胶中无RNA可见
1. 转录反应的问题
参考T7 RNA合成试剂盒（HyperScribeTM T7 High Yield RNA Synthesis Kit）方法的注意事项。
2. RNase污染
用RNaseZap(R) Solution处理所有设备及凝胶盒等，并用RNase-free的管子和试剂。
3. 加尾反应后的产物RNA与未加尾的没有可见的大小区别（在凝胶中）
1. 通过阳性对照反应检查试剂盒的组分
验证阳性对照反应结合了至少50%的放射性标记的ATP。
2.如果阳性对照没问题，但实验组的转录本出现问题
凝胶分辨率不足
如果实验组转录本有几Kb大小，琼脂糖凝胶的分辨率可能不足以分辨尺寸的变化。用标签示踪法检测反应（见下部分）
标签示踪法
如果阳性对照反应的产物比无酶反应产物更大，但实验组不是这样，那么就在加尾反应体系中加入示踪标记，通过TCA沉淀法测量结合的标记。
如果结合的标记少于50%， 但放射性标签的掺入大于背景，增加酶的用量或ATP的浓度可能实现理想长度poly (A)加尾的生成。
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