Cy2 iodine is a CY dye. CY, short for Cyanine, is a compound consisting of two nitrogen atoms connected by an odd number of methyl units. Cyanine compounds have the characteristics of long wavelength, adjustable absorption and emission, high extinction coefficient, good water solubility and relatively simple synthesis^[1]. CY dyes are of en used for the labeling of proteins, antibodies and small molecular compounds. For the labeling of protein antibodies, the combination can be completed through a simple mixing reaction. Below, we introduce the labeling method of protein antibody labeling, which has certain reference significance^[2].

原液制备
1. 蛋白准备
为了获得最佳标记效果，请将蛋白 (抗体) 浓度配制为 2 mg/mL。
1) 蛋白溶液 pH 值应为 8.5±0.5，若 pH 低于 8.0，则用 1 M 碳酸氢钠进行调整。
2) 若蛋白浓度低于 2 mg/mL，标记效率会大大降低，为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。
3) 蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 和铵离子的缓冲液中，否则会影响标记效率。
2. 染料准备
将无水 DMSO 稀释 CY 染料，制成 10 mM 储备溶液。通过玻璃管或旋涡充分混合。
注：CY 储存液建议分装后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 避光保存。
3. 染料工作液用量计算
标记反应所需的 CY 染料用量取决于要标记蛋白的用量，CY 染料与蛋白的最佳摩尔比为 10 左右。
例：假如所需标记蛋白为 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000),用 100 μL DMSO 溶解一管 1 mg CY 染料，则所需 CY 体积为 3.95 μL，详细计算流程如下 (以 CY3-NHS ester 为例) ：
1) mmol (IgG) = mg/mL (IgG) ×mL (IgG) / MW (IgG) =2 mg/mL×0.5 mL / 150,000 mg/mmol= 6.7×10-6 mmol
2) mmol (CY3-NHS ester) = mmol (IgG) ×10 =6.7×10-6 mmol×10 = 6.7×10-5 mmol
3) μL (CY3-NHS ester) = mmol (CY3-NHS ester) ×MW (CY3-NHS ester) / mg/μL (CY3-NHS ester) = 6.7×10-5 mmol× 590.15 mg/mmol / 0.01 mg/μL =3.95 μL (CY3-NHS ester)


使用方法
1. 标记反应
1) 取算好体积的新鲜配制的 10 mg/mL CY 染料缓慢加入到 0.5 mL 蛋白样品溶液中，轻轻摇匀混合，然后短暂离心将样品收集在反应管底部。切忌剧烈混匀，防止蛋白样品变性失活。
2) 将该反应小管置于避光处，在室温条件下轻轻摇晃孵育 60 分钟，每隔 10–15 分钟，将反应小管轻轻颠倒几次，以充分混合两种反应物，提高标记效率。
2. 蛋白纯化脱盐
以下方案是使用 SepHadex G-25 柱纯化染料蛋白偶联物为例。
1) 按照生产说明书制备 SepHadex G-25 柱。
2) 将反应混合物装入 SepHadex G-25 色谱柱顶部。
3) 当样品运行到顶部树脂表面下方时，立即加入 PBS (pH 7.2-7.4)。
4) 向所需样品中加入更多的 PBS (pH 7.2-7.4),完成柱纯化。结合含有所需要的染料-蛋白质缀合物的组分。

546.40

C₂₅H₂₇IN₂O₄

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