CY 为花菁 (Cyanine) 的缩写，经典的菁染料含有两个含氮杂环，分子内部含有由甲川基 (CH) n 组成的共轭链，n 可为奇数或偶数。这一特性对它们的电子结构可显著的影响电子基态下的平衡结构，共轭链两端或链中间连有杂环、芳环化合物、环烯化合物等与共轭链组成一个大的共轭体系，分子内部的氢可被一定数目的各类取代基取代。CY 系类染料常被用于蛋白，抗体以及小分子化合物的标记，对于蛋白抗体的标记，可以通过简单的混合反应来完成结合，以下我们介绍了蛋白抗体标记的标记方法，具有一定的参考意义。
| 生物活性 | Cyanines are formally compounds with two nitrogen atoms linked by an odd number of methene units. 26 28 The nitrogen atoms are parts of the heterocyclic units (such as indole, benzoxazol, or benzothiazol) . The structures and optical properties of representative cyanine dyes used for in vivo imaging are presented[1]. Cyanines are characterized by long wavelength, tunable absorption and emission, very high extinction coefficient (up to 300,000 M 1 cm 1), good water solubility, and relatively straightforward synthesis[2]. |
体外研究
(In Vitro) | 原液制备
1. 蛋白准备
为了获得最佳标记效果，请将蛋白 (抗体) 浓度配制为 2 mg/mL。
1) 蛋白溶液 pH 值应为 8.5±0.5，若 pH 低于 8.0，则用 1 M 碳酸氢钠进行调整。
2) 若蛋白浓度低于 2 mg/mL，标记效率会大大降低，为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。
3) 蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 和铵离子的缓冲液中，否则会影响标记效率。
2. 染料准备
将无水 DMSO 稀释 CY 染料，制成 10 mM 储备溶液。通过玻璃管或旋涡充分混合。
注：CY 储存液建议分装后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 避光保存。
3. 染料工作液用量计算
标记反应所需的 CY 染料用量取决于要标记蛋白的用量，CY 染料与蛋白的最佳摩尔比为 10 左右。
例：假如所需标记蛋白为 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000),用 100 μL DMSO 溶解一管 1 mg CY 染料，则所需 CY 体积为 3.95 μL，详细计算流程如下 (以 CY3-NHS ester 为例) ：
1) mmol (IgG) = mg/mL (IgG) ×mL (IgG) / MW (IgG) =2 mg/mL×0.5 mL / 150,000 mg/mmol= 6.7×10-6 mmol
2) mmol (CY3-NHS ester) = mmol (IgG) ×10 =6.7×10-6 mmol×10 = 6.7×10-5 mmol
3) μL (CY3-NHS ester) = mmol (CY3-NHS ester) ×MW (CY3-NHS ester) / mg/μL (CY3-NHS ester) = 6.7×10-5 mmol× 590.15 mg/mmol / 0.01 mg/μL =3.95 μL (CY3-NHS ester)
使用方法
1. 标记反应
1) 取算好体积的新鲜配制的 10 mg/mL CY 染料缓慢加入到 0.5 mL 蛋白样品溶液中，轻轻摇匀混合，然后短暂离心将样品收集在反应管底部。切忌剧烈混匀，防止蛋白样品变性失活。
2) 将该反应小管置于避光处，在室温条件下轻轻摇晃孵育 60 分钟，每隔 10–15 分钟，将反应小管轻轻颠倒几次，以充分混合两种反应物，提高标记效率。
2. 蛋白纯化脱盐
以下方案是使用 SepHadex G-25 柱纯化染料蛋白偶联物为例。
1) 按照生产说明书制备 SepHadex G-25 柱。
2) 将反应混合物装入 SepHadex G-25 色谱柱顶部。
3) 当样品运行到顶部树脂表面下方时，立即加入 PBS (pH 7.2-7.4)。
4) 向所需样品中加入更多的 PBS (pH 7.2-7.4),完成柱纯化。结合含有所需要的染料-蛋白质缀合物的组分。
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| 分子量 | |
| 性状 | |
| Formula | |
| CAS 号 | |
| Emission (Em) | Em 495-570 nm Green |
| Excitation (Ex) | Ex 495-570 nm Green |
| 运输条件 | Room temperature in continental US; may vary elsewhere. |
| 储存方式 | -20°C, protect from light *In solvent : -80°C, 6 months; -20°C, 1 month (protect from light) |
| 溶解性数据 | In Vitro: DMSO : ≥ 30 mg/mL(71.69 mM) *"≥" means soluble, but saturation unknown. 配制储备液 | 1 mM | 2.3895 mL | 11.9477 mL | 23.8954 mL | | 5 mM | 0.4779 mL | 2.3895 mL | 4.7791 mL | | 10 mM | 0.2390 mL | 1.1948 mL | 2.3895 mL |
*请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
储备液的保存方式和期限：-80℃, 6 months; -20℃, 1 month (protect from light)。-80℃ 储存时，请在 6 个月内使用，-20℃ 储存时，请在 1 个月内使用。 |
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