正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同，分为谷氨酸( Glu)  和鸟氨酸( Orn)  两条合成途径。吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS， Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase)是以谷氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶，对植物适应逆境胁迫起关键作用。

测定原理：

吡咯啉-5-羧酸合成酶催化谷氨酸生成 P5C 过程中分解 ATP 生成 ADP 和无机磷，通过钼酸铵比色法测定单位时间内产生无机磷的量可确定 P5CS 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、 研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 60 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 12 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：液体 12 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存，用时加入 25 mL 蒸馏水，溶解后 4℃保存一周；

试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存，用时加入 25 mL 蒸馏水，溶解后 4℃保存一周；

试剂六：液体 25mL×1 瓶，室温保存；

试剂七：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。

定磷剂的配制：按 H2O: 试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1  的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。

注意：配试剂**用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

样品酶液的制备：

1、组织样品：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL 试剂一)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清(浆)样品：直接检测。

操作步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 660nm。

2、酶促反应(在 EP 管中加入下列试剂)

混匀，37℃(哺乳动物)或 25℃(其他物种)准确水浴 10min

混匀，8000g，25℃离心 10min，取上清液

3、定磷(在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂)

混匀，室温放置 30min，在  660nm 处，记录各管吸光值。

注意：

1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒 100 管保证测 48 份 P5CS 活性。

2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。

3、空白管和标准管只要做一管。每个测定管设一个对照管。

计算

1、血清(浆)P5CS 活力的计算:

单位定义：每小时每毫升血清(浆)中 P5CS 消耗 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

P5CS 活力(μmol/h/mL)=C 标准管×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 总÷V 样÷T=9 ×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)

2、组织中 P5CS 活力的计算：

(1)按蛋白浓度计算：

单位定义：每小时每毫克组织蛋白中 P5CS 消耗 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

P5CS 活力(μmol/h/mg prot)=C 标准管×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V总÷(Cpr×V 样)÷T =9 ×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位定义：每小时每克组织中 P5CS 消耗 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

P5CS 活力(μmol/h  /g  鲜重)=C 标准管×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 总÷(W×V 样÷V 样总)÷T=9 ×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W

C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.3mL；V 样：加入样本体积，0.1mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6 小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。