正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

丙酮酸磷酸双激酶(pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1)是 C4 途径和景天科酸代谢途径的限速酶，催化 ATP、丙酮酸和 Pi 经三步反应生成磷酸烯醇式丙酮酸。该酶主要存在于 C4 植物的叶绿体基质中，对光合功能具有重要调节作用。

测定原理：

PPDK 的逆向反应催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP 和 PPi 生成丙酮酸、ATP 和 Pi，乳酸脱氢酶进一步催化丙酮酸和 NADH 生成乳酸和 NAD+，在 340nm 测定 NADH 减少速率，计算PPDK 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 25 mL×1 瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；

试剂三 ：液体 40μL×1 支，4℃保存；体积较少，若沾在管壁上，临用前可低速离心后使用。

样本的前处理：

按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤和加样表：

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定

(1)工作液的配制：临用前取试剂二一瓶加入 10mL 试剂一和 5μL 试剂三，充分混匀，置于 37℃水浴 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

(2)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 工作液，混匀，立即记录 340nm处初始吸光值 A1 和 37℃反应 5min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

PPDK 活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PPDK(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PPDK(nmol/min/g  鲜重)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=643×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PPDK(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=1286×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PPDK(nmol/min/g 鲜重)＝[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=1286×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。