产品组分

注：本产品分含体系中包含溴酚蓝、不含溴酚蓝两类。体系中包含溴酚蓝的产品，PCR扩增产物可直接电泳检测。这两类产品的扩增性能无差异。如没特别说明提供体系中包含溴酚蓝的包装。
 
保存条件
    -20℃保存2年。
    请勿保存于-70℃，防止反复冻融导致酶活降低。
 
产品说明
    Pfu Mix是2×浓缩的PCR扩增预混和溶液，含有Pfu DNA聚合酶、dNTP混合物、缓冲液等PCR扩增必需组分(模板与引物除外)。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行PCR，大大简化操作过程，缩短操作时间，降低污染(加样次数减少)。同时，由于体系内含有优化剂与增强剂，能够显著增强PCR扩增的灵敏度。扩增产物具有平末端。
    Pfu DNA聚合酶是极端嗜热性细菌Pyrococcus furiosus来源的高度热稳定DNA聚合酶，分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。扩增片段的长度可达2 kb(简单模板)。延伸速度为0.2-0.4 kb/ min(70-75℃)。该酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性。
 
产品特点
    使用方便：仅需加入模板和引物即可进行PCR扩增。
    快速、高效：减少加样步骤，节约时间。
    可重复：降低污染和加样错误风险。
 
产品用途
    高保真PCR扩增
    高通量、高重复性高保真PCR扩增
    高重复性高保真PCR扩增
    制备基因克隆或蛋白表达用的PCR产物
    位点特异性突变
 
活性定义
    一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在72℃、30 min内，摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。
 
质量控制
    相关测试表明无外源内切酶或外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶污染；PCR方法检测无宿主残余DNA，能有效扩增人基因组中的单拷贝基因；室温放置一周，扩增活性无明显改变。
 
2×PCR Pfu Mix的组分
  100 mM KCl
  200 mM Tris-Cl
  20 mM MgSO₄
  100 mM (NH₄)₂SO₄
  400 mM dNTP混合物
  0.1 U/μl Pfu DNA聚合酶等
 
应用举例
注：以下反应举例为50 μl标准PCR体系，仅供参考。

反应条件

 

备注：
    1、建议在冰上配置PCR 反应液后，再放入PCR仪中进行扩增。这有利于提高扩增的特异性，减少非特异性扩增，得到良好的PCR结果。
    2、模板DNA推荐用量(50 μl PCR反应体系)

 
Q&A
问：Pfu Mix的反应体系与普通Pfu DNA聚合酶的反应体系有何不同？
答：Pfu Mix的反应体系中除Pfu DNA聚合酶、dNTP混合物、Mg²⁺等常规组分外，还包含适当比例的PCR Enhancer与稳定剂。而且，反应体系中的离子种类与浓度也有所区别。
 
问：为什么Pfu Mix的灵敏度与扩增效率会高于普通Pfu DNA聚合酶？
答：这是由于东盛对PfuMix反应缓冲液中的成分与浓度进行了优化。我们在Pfu Mix反应缓冲液中添加了适当比例的PCR Enhancer，提高了聚合酶的热稳定性，显著降低DNA二级结构对于PCR扩增的影响。同时，对PfuMix反应缓冲液中的离子浓度与比例进行优化，使得聚合酶处于最适活性状态，从而获得了***扩增效率。
 
问：Pfu Mix的保真性与扩增片段长度是多少？
答：Pfu Mix的保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍。对于简单模板，Pfu Mix可扩增2 kb以下的片段。
 
问：Pfu Mix的扩增产物能否直接进行TA克隆？
答：不可以直接进行TA克隆。建议对PCR产物纯化后，加A再进行TA克隆。